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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 干擾/敲除 » 菌株熒光標記方法
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菌株熒光標記方法 已有1人參與
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綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)作為一種理想的活體熒光標記分子，越來越多地被用于活細胞或微生物的定位、結構和動力學的研究，也可以通過測定GFP的熒光強度對菌株中GFP的表達量進行定量分析[1]。GFP已經在許多細菌中完成了轉化，如：（1）利用GFP追蹤了乳酸乳球菌WH-C1在小鼠腸道內的定植情況；（2）利用GFP發(fā)現德氏乳桿菌D17嵌入在黏液層中，局部接近腸道的上皮細胞；（3）在植物乳桿菌WCFS1中進行GFP標記，研究WCFS1在腸道內的定植與分布。 紅色熒光蛋白 (Red Fluorescent Protein, RFP)相比綠色熒光蛋白 (GFP)其靈敏度更高, 是基于GFP基礎上的一種優(yōu)良穩(wěn)定的熒光蛋白。目前已在不同的菌株中成功進行RFP標記，如：（1）在根瘤菌中進行RFP熒光標記，可探究根瘤菌結瘤固氮能力及根瘤菌與土著菌競爭關系 [2]；（2）構建了以紅色熒光蛋白基因 (dsred2) 為標記, 以α-淀粉酶 (amy) 為報告基因的表達載體, 成功實現了融合基因dsred2-amy在干酪乳桿菌中的融合表達；（3）銅綠假單胞菌中轉入RFP標記，證實其在含油多孔物質中的遷移擴散及所受限制[3]；（4）在幽門26695中構建了GFP和RFP熒光標記，用于探究幽門的遺傳調控和信號追蹤[4]。 mCherry熒光蛋白也叫櫻桃熒光蛋白，是從蘑菇珊瑚（mushroom coral）中分離出來的單體紅色熒光蛋白，相較于其它單體熒光蛋白，其顏色和單體分子的光穩(wěn)定性更強。mCherry熒光標記技術在細胞生物學、分子生物學和神經科學等多個領域都有廣泛應用，用于追蹤蛋白質、細胞器或其他生物大分子在活細胞中的分布和動態(tài)。近年來, mCherry用于熒光標記的研究報道逐漸增多, 相對其他熒光蛋白, 該熒光標記具有標記基因小、背景低等優(yōu)點, 且與已報道的dsred2紅色熒光基因相比, 其熒光強度及穩(wěn)定性更好。目前已成功在多種菌株中進行標記：如：（1）成功在蒙氏腸球菌ST4SA和植物乳桿菌423中進行mCherry熒光蛋白標記；（2）在植物乳桿菌中進行mCherry熒光蛋白標記，是探究其在生物體內的定位、示蹤及益生性作用機制的有效技術手段[5]。 實驗流程： 1：構建熒光標記載體； 2：電轉至受體菌； 3：涂布抗性篩選平板； 4：抗性篩選培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)； 5：PCR驗證質粒是否存在； 6：紫外驗證熒光； 7：抗性篩選培養(yǎng)基擴大培養(yǎng) 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
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| 好 |
2樓2024-05-28 10:51:26
3樓2024-05-29 09:39:52
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