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熒光素酶互補(bǔ)（Luc）實(shí)驗(yàn)
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【導(dǎo)入】基于熒光素酶（Luciferase）的發(fā)光原理，形成了雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括螢火蟲熒光素酶（Firefly luciferase）和海參熒光素酶（Renilla luciferase）。兩者可與各自的底物發(fā)生氧化作用產(chǎn)生生物熒光，產(chǎn)生的熒光值即表示兩種酶的表達(dá)量多少。 Firefly luciferase和Renilla luciferase被稱為報(bào)告基因，是因?yàn)樵诒磉_(dá)調(diào)控研究時(shí)，利用兩者表達(dá)產(chǎn)生的熒光比值可監(jiān)控微觀層面上的分子間相互作用。 具體做法：將靶基因的的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件或5'啟動(dòng)子區(qū)融合在Firefly luciferase基因的上游，把3‘-UTR區(qū)或IncRNA序列融合在Firefly luciferase基因的下游，以研究啟動(dòng)子的強(qiáng)弱和轉(zhuǎn)錄因子對(duì)啟動(dòng)子的作用，或miRNA對(duì)目的基因/IncRNA的調(diào)控作用。 該系統(tǒng)中引入Renilla luciferase基因的TK載體作為內(nèi)參，以消除細(xì)胞轉(zhuǎn)染等因素帶來(lái)的組間誤差。 其中l(wèi)uciferase來(lái)源于細(xì)菌、螢火蟲和發(fā)光海洋生物等，可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞中直接表達(dá)，無(wú)需表達(dá)后修飾，直接具備完全酶活性。 與GFP不同之處在于luciferase的發(fā)光檢測(cè)不需要激發(fā)光激發(fā)，且發(fā)光穿透力更強(qiáng)，這使得Luc實(shí)驗(yàn)具備可定量、高靈敏度及背景低等特點(diǎn)。 【利用熒光素酶互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證植物蛋白互作】 基本原理 在驗(yàn)證植物蛋白互作時(shí)，熒光素酶互補(bǔ)實(shí)驗(yàn) (Luciferase Complementation Assay, LCA) 因其高靈敏度、可定量化、操作簡(jiǎn)單高效被廣泛應(yīng)用于植物學(xué)和動(dòng)物學(xué)蛋白質(zhì)互作研究。 目前, 應(yīng)用最為廣泛的熒火素酶基因來(lái)源于北美螢火蟲 (firefly luciferase), 該基因編碼550個(gè)氨基酸組成的熒火素酶蛋白 (大小為62 kDa)。 實(shí)驗(yàn)中, 熒光素酶蛋白被切成 N端 和 C端 2個(gè)功能片段, 即 NLuc (2–416AA) 和 CLuc (398–550AA) 。 在一個(gè)實(shí)驗(yàn)體系中, 待檢測(cè)的2個(gè)目標(biāo)蛋白分別與NLuc和CLuc融合, 如果2個(gè)目標(biāo)蛋白相互作用, 則熒火素酶的NLuc和CLuc在空間上會(huì)足夠靠近并正確組裝, 從而發(fā)揮熒火素酶活性, 即分解底物產(chǎn)生熒光 。 實(shí)驗(yàn)過(guò)程 將含有融合蛋白的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 (Agrobacterium) 后注射煙草葉片。24–48小時(shí)后，加入反應(yīng)底物熒火素, 利用植物活體分子影像系統(tǒng) (CCD imaging system) 或luminometer來(lái)定性定量檢測(cè)熒光強(qiáng)度, 以判定目標(biāo)蛋白之間是否存在相互作用及互作的程度。 畢合生物（www.bihebio.com)提供服務(wù)內(nèi)容：分子生物學(xué)、免疫, 重組蛋白及ELISA相關(guān)、活性小分子化合物、高端化學(xué)、材料化學(xué)、細(xì)胞資源庫(kù)與培養(yǎng)相關(guān)、生命科學(xué)、天然產(chǎn)物 |
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