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干貨分享 | 你不可不知的數(shù)字PCR技術 已有1人參與
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今天，我們聊一聊dPCR技術，首先，我們先了解下什么是dPCR？ dPCR：數(shù)字PCR（Digital PCR，dPCR），通過將待測樣本進行極限稀釋，使每個反應室中平均只有一個拷貝或者沒有目標DNA分子，然后加入熒光信號進行PCR擴增，可以檢測到低至一個拷貝的突變。 dPCR檢測原理：數(shù)字PCR是一種核酸檢測和絕對定量的新方法。同傳統(tǒng)PCR以及qPCR相比，數(shù)字PCR增加了一步分液(partitioning)的操作，將幾十微升的已經配好的包含有引物、模板、buffer、酶等組分的PCR反應體系分隔成了眾多微小的、獨立的反應體系，這樣能夠直接數(shù)出DNA分子的個數(shù)，對起始樣品絕對定量，通過將一個樣本分成幾萬到幾百萬份，分配到不同的反應單元，每個單元包含一個或多個拷貝的目標分子( DNA 模板) ，在每個反應單元中分別對目標分子進行PCR擴增，擴增結束后對各個反應單元的熒光信號進行統(tǒng)計學分析，有熒光信號記為1，無熒光信號記為0（不同于qPCR 對每個循環(huán)進行實時熒光測定的方法，數(shù)字 PCR 技術是在擴增結束后對每個反應單元的熒光信號進行采集）。 在分配的過程中，引物、酶等組分過量，而模板則是不過量的。模板DNA分子隨機地進入到各個小的反應體系中，經過PCR擴增后，包含模板的體系完成擴增，不包含模板的體系無擴增（ddPCR的原理與熒光PCR的反應原理和是一樣的，可以設計TaqMan探針、分子信標探針或者采用染料法進行檢測，伯樂公司推薦使用BHQ1作為粹滅基因）。 模板DNA分子進入各個小的反應體系的過程滿足泊松分布規(guī)律，因此，檢測擴增PCR產物的信號強度，帶入泊松分布公式計算，即可計算出起始模板DNA分子的拷貝數(shù)。 超強的泊松統(tǒng)計：由于dPCR是一種終端分析法，如果目標分子沒有很好的離散化，如一些小室在結束時具有不止一個的靶標（比如說在一個液滴中同時出現(xiàn)了幾種突變的靶標，列如KRAS、EGFR、BRAF和TP53等），那么理論上結果得到的濃度可能就會棄之不用。這就是泊松統(tǒng)計發(fā)揮作用的地方。 據(jù)Bio-Rad實驗室數(shù)字生物學中心科學事務部主任GeorgeKarlin-Neumann稱，泊松統(tǒng)計描述了一種隨機分布。只要小室沒有達到飽和，用戶就可以反算他們起始的分子數(shù)，即使一些孔中實際上容納了不止一個分子（這種情況在數(shù)字PCR中讀做單一計數(shù)）。只要你告訴我你有多少小室或者多少液滴，（并且）它們中多大比例呈陰性。它就會基本上告訴我初始的濃度，這也將告訴我陽性小室與陰性小室的比例。 分子混合物被離散或分隔化到大量的反應室中（越多越好），這樣每個室中平均有一個或零個目標核苷酸。對每個區(qū)劃進行PCR反應后，使用泊松統(tǒng)計將陽性信號的計數(shù)轉換為一個絕對值。 如果將這一過程比作一代測序（Sanger測序），在單個管中對100個模板分子的混合物（其中有一個是突變的）進行測序會產生一個電泳圖譜，其中在突變位點上的顯著信號會是野生型堿基。 你甚至基本不會發(fā)現(xiàn)，在（信號峰）下存在著一個表示不同堿基讀取的小突起，因為它在整個分子混合物中的占比太低了。但將這些分子稀釋并將其分布在多重反應中，就能產生出99個野生型信號和一個明顯的突變信號，這就是數(shù)字的、絕對定量的結果，也是dPCR最大的優(yōu)勢之處。 dPCR與qPCR比較 數(shù)字PCR與傳統(tǒng)PCR技術不同，數(shù)字PCR采用絕對定量的方式，采用的策略簡單概括就是“分而治之”，類似于計算機科學中的“分治算法”，將一個標準PCR反應分配到大量微小的反應器中，在每個反應器中包含或不包含一個或多個拷貝的目標分子( DNA模板) ，實現(xiàn)“單分子模板PCR擴增”，擴增結束后，通過陽性反應器的數(shù)目“數(shù)出”目標序列的拷貝數(shù)，特別適合在復雜背景中檢測稀有突變。 數(shù)字PCR“分而治之” 國家食品藥品監(jiān)督管理總局對數(shù)字PCR的工作原理描述：對目標核酸序列定量和定性檢測，用聚合酶鏈式反應分析法，將具有熒光定量PCR的反應物(TaqMan探針法或SYBR綠色引物法)加載到芯片上，然后用dPCR擴增儀進行熱循環(huán)反應。芯片反應完成后放到dPCR分析儀上進行成像和分析，輸出原始數(shù)據(jù)，將原始數(shù)據(jù)放到云端的dPCR軟件上分析，并得到最終結果。儀器每處理一個芯片，只要一分鐘儀器就能讀完芯片。 整個實驗主要操作步驟 dPCR檢測技術點評 優(yōu)點： 1，靈敏度高，可檢測低至0.1%的突變； 2，能夠進行絕對定量，不依賴對照品或標準品； 3，操作過程簡單； 4，結果分析簡單。 缺點： 1，通量較低（一管最高10重反應） 2，需要特殊儀器設備； 3，適用范圍較為單一； 4，檢測成本較高。 此方法適宜于對ctDNA或者其他低濃度樣本的低頻突變進行檢測，特別適用于“液體活檢”。 |
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Turtle_tech
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數(shù)字PCR（Digital PCR，dPCR）是20世紀90年代末發(fā)展起來的一種核酸分子絕對定量技術。不需要標準品，也不要制作標準曲線，在精密度、準確度和靈敏度方面有無與倫比的優(yōu)勢。 數(shù)字PCR具有明顯的優(yōu)勢，已經廣泛應用于核酸檢測的方方面面。腫瘤液態(tài)活檢，遺傳生殖檢測，公共衛(wèi)生檢測，環(huán)境微生物檢測，RNA表達檢測，NGS文庫定量，甲基化檢測的等。 腫瘤液態(tài)活檢 稀有基因突變 基因拷貝數(shù)變異 基因甲基化早篩 微小殘留病灶 腫瘤耐藥性監(jiān)測 2. 傳染病/感染性疾病 超多重呼吸道感染 超多重創(chuàng)傷弧菌感染 超多重血流感染 病原微生物基因分型 3. 遺傳生殖 21三體綜合征檢測 脊髓型肌肉萎縮癥檢測 RhD陰性血檢測 耳聾基因檢測 4. 生物制藥 腺相關病毒滴度定量 干細胞、Car-T細胞、NK細胞等質控 基因編輯定量與質控 宿主細胞痕量殘留DNA檢測 RNA疫苗基因變異定量檢測 5. 標準物質 核酸標準物質定值 企業(yè)參考品定值 測序文庫定值 核酸質控品定值 6. 環(huán)境微生物檢測 水質環(huán)境微生物檢測 畜牧環(huán)境致病菌檢測 地質古菌微生物檢測 7. 農林牧漁 分子育種、品質改良 農作物致病菌防治 水產養(yǎng)殖致病菌檢測 動物疫病檢測與防控 8. 食品安全/檢驗檢疫 轉基因作物/食品 進出口視頻致病病原 動物源性食品檢測 微生物痕量基因殘留 |
2樓2024-03-14 14:40:59
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