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專業(yè): 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)

[交流] 干貨分享 | 你不可不知的數(shù)字PCR技術(shù) 已有1人參與

今天，我們聊一聊dPCR技術(shù)，首先，我們先了解下什么是dPCR？

dPCR：數(shù)字PCR（Digital PCR，dPCR），通過將待測樣本進(jìn)行極限稀釋，使每個(gè)反應(yīng)室中平均只有一個(gè)拷貝或者沒有目標(biāo)DNA分子，然后加入熒光信號進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可以檢測到低至一個(gè)拷貝的突變。

dPCR檢測原理：數(shù)字PCR是一種核酸檢測和絕對定量的新方法。同傳統(tǒng)PCR以及qPCR相比，數(shù)字PCR增加了一步分液(partitioning)的操作，將幾十微升的已經(jīng)配好的包含有引物、模板、buffer、酶等組分的PCR反應(yīng)體系分隔成了眾多微小的、獨(dú)立的反應(yīng)體系，這樣能夠直接數(shù)出DNA分子的個(gè)數(shù)，對起始樣品絕對定量，通過將一個(gè)樣本分成幾萬到幾百萬份，分配到不同的反應(yīng)單元，每個(gè)單元包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的目標(biāo)分子( DNA 模板) ，在每個(gè)反應(yīng)單元中分別對目標(biāo)分子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后對各個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，有熒光信號記為1，無熒光信號記為0（不同于qPCR 對每個(gè)循環(huán)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光測定的方法，數(shù)字 PCR 技術(shù)是在擴(kuò)增結(jié)束后對每個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號進(jìn)行采集）。

在分配的過程中，引物、酶等組分過量，而模板則是不過量的。模板DNA分子隨機(jī)地進(jìn)入到各個(gè)小的反應(yīng)體系中，經(jīng)過PCR擴(kuò)增后，包含模板的體系完成擴(kuò)增，不包含模板的體系無擴(kuò)增（ddPCR的原理與熒光PCR的反應(yīng)原理和是一樣的，可以設(shè)計(jì)TaqMan探針、分子信標(biāo)探針或者采用染料法進(jìn)行檢測，伯樂公司推薦使用BHQ1作為粹滅基因）。
模板DNA分子進(jìn)入各個(gè)小的反應(yīng)體系的過程滿足泊松分布規(guī)律，因此，檢測擴(kuò)增PCR產(chǎn)物的信號強(qiáng)度，帶入泊松分布公式計(jì)算，即可計(jì)算出起始模板DNA分子的拷貝數(shù)。

超強(qiáng)的泊松統(tǒng)計(jì)：由于dPCR是一種終端分析法，如果目標(biāo)分子沒有很好的離散化，如一些小室在結(jié)束時(shí)具有不止一個(gè)的靶標(biāo)（比如說在一個(gè)液滴中同時(shí)出現(xiàn)了幾種突變的靶標(biāo)，列如KRAS、EGFR、BRAF和TP53等），那么理論上結(jié)果得到的濃度可能就會棄之不用。這就是泊松統(tǒng)計(jì)發(fā)揮作用的地方。

據(jù)Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室數(shù)字生物學(xué)中心科學(xué)事務(wù)部主任GeorgeKarlin-Neumann稱，泊松統(tǒng)計(jì)描述了一種隨機(jī)分布。只要小室沒有達(dá)到飽和，用戶就可以反算他們起始的分子數(shù)，即使一些孔中實(shí)際上容納了不止一個(gè)分子（這種情況在數(shù)字PCR中讀做單一計(jì)數(shù)）。只要你告訴我你有多少小室或者多少液滴，（并且）它們中多大比例呈陰性。它就會基本上告訴我初始的濃度，這也將告訴我陽性小室與陰性小室的比例。

分子混合物被離散或分隔化到大量的反應(yīng)室中（越多越好），這樣每個(gè)室中平均有一個(gè)或零個(gè)目標(biāo)核苷酸。對每個(gè)區(qū)劃進(jìn)行PCR反應(yīng)后，使用泊松統(tǒng)計(jì)將陽性信號的計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)換為一個(gè)絕對值。

如果將這一過程比作一代測序（Sanger測序），在單個(gè)管中對100個(gè)模板分子的混合物（其中有一個(gè)是突變的）進(jìn)行測序會產(chǎn)生一個(gè)電泳圖譜，其中在突變位點(diǎn)上的顯著信號會是野生型堿基。

你甚至基本不會發(fā)現(xiàn)，在（信號峰）下存在著一個(gè)表示不同堿基讀取的小突起，因?yàn)樗谡麄€(gè)分子混合物中的占比太低了。但將這些分子稀釋并將其分布在多重反應(yīng)中，就能產(chǎn)生出99個(gè)野生型信號和一個(gè)明顯的突變信號，這就是數(shù)字的、絕對定量的結(jié)果，也是dPCR最大的優(yōu)勢之處。

dPCR與qPCR比較

數(shù)字PCR與傳統(tǒng)PCR技術(shù)不同，數(shù)字PCR采用絕對定量的方式，采用的策略簡單概括就是“分而治之”，類似于計(jì)算機(jī)科學(xué)中的“分治算法”，將一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)分配到大量微小的反應(yīng)器中，在每個(gè)反應(yīng)器中包含或不包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的目標(biāo)分子( DNA模板) ，實(shí)現(xiàn)“單分子模板PCR擴(kuò)增”，擴(kuò)增結(jié)束后，通過陽性反應(yīng)器的數(shù)目“數(shù)出”目標(biāo)序列的拷貝數(shù)，特別適合在復(fù)雜背景中檢測稀有突變。

數(shù)字PCR“分而治之”

國家食品藥品監(jiān)督管理總局對數(shù)字PCR的工作原理描述：對目標(biāo)核酸序列定量和定性檢測，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析法，將具有熒光定量PCR的反應(yīng)物(TaqMan探針法或SYBR綠色引物法)加載到芯片上，然后用dPCR擴(kuò)增儀進(jìn)行熱循環(huán)反應(yīng)。芯片反應(yīng)完成后放到dPCR分析儀上進(jìn)行成像和分析，輸出原始數(shù)據(jù)，將原始數(shù)據(jù)放到云端的dPCR軟件上分析，并得到最終結(jié)果。儀器每處理一個(gè)芯片，只要一分鐘儀器就能讀完芯片。

整個(gè)實(shí)驗(yàn)主要操作步驟

dPCR檢測技術(shù)點(diǎn)評

優(yōu)點(diǎn)：

1，靈敏度高，可檢測低至0.1%的突變；

2，能夠進(jìn)行絕對定量，不依賴對照品或標(biāo)準(zhǔn)品；

3，操作過程簡單；

4，結(jié)果分析簡單。

缺點(diǎn)：

1，通量較低（一管最高10重反應(yīng)）

2，需要特殊儀器設(shè)備；

3，適用范圍較為單一；

4，檢測成本較高。

此方法適宜于對ctDNA或者其他低濃度樣本的低頻突變進(jìn)行檢測，特別適用于“液體活檢”。

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Turtle_tech

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數(shù)字PCR（Digital PCR，dPCR）是20世紀(jì)90年代末發(fā)展起來的一種核酸分子絕對定量技術(shù)。不需要標(biāo)準(zhǔn)品，也不要制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，在精密度、準(zhǔn)確度和靈敏度方面有無與倫比的優(yōu)勢。

數(shù)字PCR具有明顯的優(yōu)勢，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于核酸檢測的方方面面。腫瘤液態(tài)活檢，遺傳生殖檢測，公共衛(wèi)生檢測，環(huán)境微生物檢測，RNA表達(dá)檢測，NGS文庫定量，甲基化檢測的等。

腫瘤液態(tài)活檢
稀有基因突變
基因拷貝數(shù)變異
基因甲基化早篩
微小殘留病灶
腫瘤耐藥性監(jiān)測
2. 傳染病/感染性疾病

超多重呼吸道感染
超多重創(chuàng)傷弧菌感染
超多重血流感染
病原微生物基因分型
3. 遺傳生殖

21三體綜合征檢測
脊髓型肌肉萎縮癥檢測
RhD陰性血檢測
耳聾基因檢測
4. 生物制藥

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2樓2024-03-14 14:40:59

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