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實(shí)驗(yàn)技巧 | RNA-FISH不難，和小助手一起撥開云霧見月明
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在基礎(chǔ)科研領(lǐng)域，mRNA、IncRNA、circRNA、miRNA是科研界的寵兒，吸引著無數(shù)科研狗們前仆后繼。打開pubmed搜索RNA的文章，許多篇都有RNA熒光原位雜交（RNA-FISH）的身影，然而受限于實(shí)驗(yàn)儀器，技術(shù)或者經(jīng)費(fèi)的影響，對于一些碩博生們，RNA-FISH始終如那海市蜃樓，可望而不及。沒關(guān)系，今天科研狗小助手帶你手把手做RNA-FISH。 一、原理 熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)是一種利用熒光標(biāo)記的核酸片段為探針，與組織、細(xì)胞或染色體上待測DNA或RNA互補(bǔ)配對，結(jié)合成專一的核酸雜交分子，通過熒光檢測系統(tǒng)將待測核酸在組織、細(xì)胞或染色體中的位置顯示出來的技術(shù)。 如果待檢測的細(xì)胞或組織切片上的靶核酸與所用的核酸探針是同源互補(bǔ)的，二者經(jīng)變性-退火-復(fù)性，即可形成靶核酸與核酸探針的雜交體。將核酸探針的某一種核苷酸標(biāo)記上報(bào)告分子如生物素或直接標(biāo)記熒光素，可利用該報(bào)告分子與熒光素標(biāo)記的特異親和素之間的免疫化學(xué)反應(yīng)或直接經(jīng)熒光檢測體系在鏡下對待測核酸（mRNA、lncRNA、circRNA、miRNA）進(jìn)行定性、半定量或相對定位分析的一種實(shí)驗(yàn)方法。 1、樣本準(zhǔn)備 （1）載波片處理 1%鹽酸酒精充分浸泡蓋玻片，加蓋，浸泡 1h 以上。流水沖洗蓋玻片（控制流速，勿沖出蓋玻片)；滅菌雙蒸水洗4-5遍，室溫，振蕩洗滌；無水乙醇泡3次，每次數(shù)分鐘；傾去乙醇，放入溫度為60°C左右烤箱烘干數(shù)小時(shí)，高壓滅菌烤干； （2）收獲分化不同時(shí)期細(xì)胞。 2、固定及透化 （1）1X PBS 洗一次細(xì)胞； （2）室溫，4%多聚甲醛固定10 min； （3）1X PBS洗細(xì)胞，3次，每次 1min； （4）每孔加入1ml預(yù)冷的通透液，置于4度冰箱，5min； （5）棄去通透液； （6）1X PBS洗細(xì)胞，3次，每次加入1ml。 3、檢測細(xì)胞或組織中的RNA （1）用鉆石筆在切片背面圈定用于原位雜交的范圍； （2）雜交前，先將切片置于約200ul預(yù)雜交液中封閉，20-25度，20min； （3）同時(shí)，將雜交液預(yù)熱于同上溫度中； （4）在探針混合液稀釋好待用前，不要將預(yù)雜交液從切片上棄去； （5）切片需置于濕盒中； （6）雜交1小時(shí)，所用溫度與預(yù)雜交溫度相同，每張切片用 100-300ul的雜交液，應(yīng)當(dāng)小心吸取雜交液于切片上，確保雜交液充分覆蓋切片； （7）用洗液I洗片，3次，每次5min，所用溫度與之前相同，需避光； （8）用洗液II洗片，1次，5min，所用溫度與之前相同，需避光； （9）用洗液III洗片，次，5min，所用溫度與之前相同，需避光； （10）最后，用1X PBS洗片，1次，5min，室溫，需避光。 4、核染 （1）加入DAPI溶液，避光孵育5min； （2）用1X PBS洗片，3次，每次5min，室溫，需用搖床。 5、封片 （1）棄去PBS，加入封片液，用蓋玻片蓋好，將切片豎立 2min 以使其干燥，需避光； （2）加入防熒光猝滅劑，用指甲油封片，避免起泡。 6、圖像采集 激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察，進(jìn)行圖像采集。 7、數(shù)據(jù)處理 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。 |
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庚辰辛丑2樓
2024-03-07 18:17
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2024-03-07 18:18
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假大空4樓
2024-03-07 20:00
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tzynew5樓
2024-03-07 20:15
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nono20096樓
2024-03-08 21:34
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