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實驗技巧 | RNA-FISH不難，和小助手一起撥開云霧見月明
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在基礎科研領域，mRNA、IncRNA、circRNA、miRNA是科研界的寵兒，吸引著無數(shù)科研狗們前仆后繼。打開pubmed搜索RNA的文章，許多篇都有RNA熒光原位雜交（RNA-FISH）的身影，然而受限于實驗儀器，技術或者經(jīng)費的影響，對于一些碩博生們，RNA-FISH始終如那海市蜃樓，可望而不及。沒關系，今天科研狗小助手帶你手把手做RNA-FISH。 一、原理 熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)是一種利用熒光標記的核酸片段為探針，與組織、細胞或染色體上待測DNA或RNA互補配對，結合成專一的核酸雜交分子，通過熒光檢測系統(tǒng)將待測核酸在組織、細胞或染色體中的位置顯示出來的技術。 如果待檢測的細胞或組織切片上的靶核酸與所用的核酸探針是同源互補的，二者經(jīng)變性-退火-復性，即可形成靶核酸與核酸探針的雜交體。將核酸探針的某一種核苷酸標記上報告分子如生物素或直接標記熒光素，可利用該報告分子與熒光素標記的特異親和素之間的免疫化學反應或直接經(jīng)熒光檢測體系在鏡下對待測核酸（mRNA、lncRNA、circRNA、miRNA）進行定性、半定量或相對定位分析的一種實驗方法。 1、樣本準備 （1）載波片處理 1%鹽酸酒精充分浸泡蓋玻片，加蓋，浸泡 1h 以上。流水沖洗蓋玻片（控制流速，勿沖出蓋玻片)；滅菌雙蒸水洗4-5遍，室溫，振蕩洗滌；無水乙醇泡3次，每次數(shù)分鐘；傾去乙醇，放入溫度為60°C左右烤箱烘干數(shù)小時，高壓滅菌烤干； （2）收獲分化不同時期細胞。 2、固定及透化 （1）1X PBS 洗一次細胞； （2）室溫，4%多聚甲醛固定10 min； （3）1X PBS洗細胞，3次，每次 1min； （4）每孔加入1ml預冷的通透液，置于4度冰箱，5min； （5）棄去通透液； （6）1X PBS洗細胞，3次，每次加入1ml。 3、檢測細胞或組織中的RNA （1）用鉆石筆在切片背面圈定用于原位雜交的范圍； （2）雜交前，先將切片置于約200ul預雜交液中封閉，20-25度，20min； （3）同時，將雜交液預熱于同上溫度中； （4）在探針混合液稀釋好待用前，不要將預雜交液從切片上棄去； （5）切片需置于濕盒中； （6）雜交1小時，所用溫度與預雜交溫度相同，每張切片用 100-300ul的雜交液，應當小心吸取雜交液于切片上，確保雜交液充分覆蓋切片； （7）用洗液I洗片，3次，每次5min，所用溫度與之前相同，需避光； （8）用洗液II洗片，1次，5min，所用溫度與之前相同，需避光； （9）用洗液III洗片，次，5min，所用溫度與之前相同，需避光； （10）最后，用1X PBS洗片，1次，5min，室溫，需避光。 4、核染 （1）加入DAPI溶液，避光孵育5min； （2）用1X PBS洗片，3次，每次5min，室溫，需用搖床。 5、封片 （1）棄去PBS，加入封片液，用蓋玻片蓋好，將切片豎立 2min 以使其干燥，需避光； （2）加入防熒光猝滅劑，用指甲油封片，避免起泡。 6、圖像采集 激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察，進行圖像采集。 7、數(shù)據(jù)處理 進行數(shù)據(jù)處理。 |
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庚辰辛丑2樓
2024-03-07 18:17
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2024-03-07 18:18
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假大空4樓
2024-03-07 20:00
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tzynew5樓
2024-03-07 20:15
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o 發(fā)自小木蟲Android客戶端
nono20096樓
2024-03-08 21:34
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科研蟲子小助手(金幣+1): 謝謝參與
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