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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 生物信息 » 蛋白質純化與結晶的原理
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蛋白質純化與結晶的原理
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獲得蛋白質的晶體結構的第一個瓶頸，就是制備大量純化的蛋白質（>10mg），其濃度通常在10mg/ml以上，并以此為基礎進行結晶條件的篩選。運用重組基因的技術，將特定基因以選殖（clone）的方式嵌入表現(xiàn)載體（expression vector）內，此一載體通常具有易于調控的特性。之后再將帶有特定基因的載體送入可快速生長的菌體中，如大腸桿菌（Escherichia coli），在菌體快速生長的同時，也大量生產表現(xiàn)載體上的基因所解譯出之蛋白質。一般而言純度越高的蛋白質比較有機會形成晶體，因此純化蛋白質的步驟就成為一個重要的決定因素。 在取得高純度的蛋白質溶液后，接下來就是晶體的培養(yǎng)。蛋白質晶體與其他化合物晶體的形成類似，是在飽和溶液中慢慢產生的，每一種蛋白質養(yǎng)晶的條件皆有所差異，影響晶體形成的變量很多，包含化學上的變量，如酸堿度、沉淀劑種類、離子濃度、蛋白質濃度等；物理上的變數(shù)，如溶液達成過飽和狀態(tài)的速率、溫度等；及生化上的變數(shù)，如蛋白質所需的金屬離子或抑制劑、蛋白質的聚合狀態(tài)、等電點等，皆是養(yǎng)晶時的測試條件。截至目前為止，并無一套理論可以預測結晶的條件，所以必須不斷測試各種養(yǎng)晶溶液的組合后，才可能得到一顆完美的單一晶體。 蛋白質晶體的培養(yǎng)，通常是利用氣相擴散法（Vapor Diffusion Method）的原理來達成；也就是將含有高濃度的蛋白質（10～50mg/ml）溶液加入適當?shù)娜軇�，慢慢降低蛋白質的溶解度，使其接近自發(fā)性的沈淀狀態(tài)時，蛋白質分子將在整齊的堆棧下形成晶體。舉例來說，我們將蛋白質溶于低濃度（~1.0M）的硫酸銨溶液中，將它放置于一密閉含有高濃度（~2.0M）硫酸銨溶液的容器中，由氣相平衡，可以緩慢提高蛋白質溶液中硫酸銨的濃度，進而達成結晶的目的。 蛋白質晶體在外觀上與其他晶體并無明顯不同之處，但在晶體的內部，卻有很大的差異。一般而言，蛋白質晶體除了蛋白質分子外，其他的空間則充滿約40%至60%之間的水溶液，其液態(tài)的成分不僅使晶體易碎，也容易使蛋白質分子在晶格排列上有不規(guī)則的情形出現(xiàn)，造成晶體處理時的困難及繞射數(shù)據(jù)上的搜集不易等缺點。但也由于高含水量的特性，讓蛋白質分子在晶體內與水溶液中的狀態(tài)，極為相似。所以由晶體所解出的蛋白質結構，基本上可視為自然狀態(tài)下的結構。 |
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