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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 核酸提取 » 提取質粒求助
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天兆9611鐵蟲 (小有名氣)
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[求助]
提取質粒求助 已有1人參與
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提取革蘭氏陽性菌中pSIP 411質粒，按照天根高純質粒小提取試劑盒方法提取，具體步驟如下： 1.柱平衡步驟：向吸附柱CP4中（吸附柱放入收集管中）加入500 µL的平衡液BL, 12,000 rpm離心1 min,倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。 2.取2 mL過夜培養(yǎng)的菌液加入離心管中，12,000 rpm離心1 min,盡量吸除上清。 3.向留有菌體沉淀的離心管中加入500 µL溶液P1（已加入RNase A）,使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細菌細胞沉淀，加入70 µL溶菌酶37 ℃處理30 min 。 4.向離心管中加入500 µL溶液P2,溫和地上下翻轉6-8次使菌體充分裂解。 5.向離心管中加入700 µL溶液P3,立即溫和地上下翻轉6-8次，充分混勻，此時會出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12,000 rpm離心10 min，此時在離心管底部形成沉淀。 6.將上一步收集的上清液分次加入過濾柱CS（過濾柱放入收集管中）, 12000 rpm離心2 min,小心地將離心后收集管中得到的溶液分次加入吸附柱CP4中 7.12,000 rpm離心1 min,倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP4放入收集管中。 8.向吸附柱CP4中加入500 µL去蛋白液PD, 12000 rpm離心1 min,倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP4放入收集管中。 9.向吸附柱CP4中加入600 µL漂洗液PW (已加入無水乙醇)，12000 rpm離心1 min,倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP4放入收集管中。 10.重復操作步驟9 11.將吸附柱CP4重新放回收集管中置于12,000 rpm離心2 min,目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除。 12.將吸附柱CP4置于一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加60 µL洗脫緩沖液TB,室溫放置2 min, 12000 rpm離心1 min將質粒溶液收集到離心管中，將溶液再次加入到吸附膜上室溫放置2 min，12000 rpm離心1 min之后保存在-20 ℃中。 以上提取完質粒后進行電泳，使用1%的膠，150 V 25 min（機器比較老了，以前150 V 15 min就可以了），染劑是gel red，之后照膠的圖是這樣的請問有大神支個招嗎？需要做什么優(yōu)化和改進？ |
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天兆9611
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3樓2023-06-12 16:25:39
天兆9611
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5樓2023-06-16 10:37:32
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