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Sh畢合生物
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[交流]
轉(zhuǎn)膜時(shí)大分子量和小分子量蛋白，該如何選擇膜孔徑? 已有1人參與
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對(duì)所有的蛋白，我們推薦用 Nitrocellulose Sandwiches #12369（0.2 μm）的雜交膜去轉(zhuǎn)膜，尤其是分子量低于 30 KD 的蛋白，建議使用較高濃度（12-15%）的蛋白分離膠并縮短轉(zhuǎn)膜的時(shí)間，建議在 1 小時(shí)以?xún)?nèi)。 大分子量蛋白（> 150 kDa）推薦使用 tris-acetate SDS-PAGE 凝膠系統(tǒng)，而不是傳統(tǒng)的（tris-glycine），以及 5% 的甲醇。因?yàn)?tris-acetate 凝膠是在一個(gè)中性 pH 的條件下，所以分辨率比較高而且遷移的也更加精準(zhǔn)。 低濃度的甲醇可以使轉(zhuǎn)膜的效率更高（25 mM Tris base，0.2 M glycine，5% methanol）。長(zhǎng)時(shí)間的轉(zhuǎn)膜（3 小時(shí)，70 伏）也是很有幫助的。對(duì) mTOR 來(lái)說(shuō)長(zhǎng)時(shí)間的轉(zhuǎn)膜可能不一定有效，因?yàn)?mTOR 是個(gè)高表達(dá)蛋白，一般來(lái)說(shuō)用常規(guī)的 protocol 也可以得到比較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但是對(duì)于 BRCA1，ATM，ATR 等這些大分子量蛋白還是十分有幫助的。 作者：畢合生物 公眾號(hào)：畢合生物 畢合生物提供服務(wù)內(nèi)容：分子生物學(xué)、免疫, 重組蛋白及ELISA相關(guān)、活性小分子化合物、高端化學(xué)、材料化學(xué)、細(xì)胞資源庫(kù)與培養(yǎng)相關(guān)、生命科學(xué)、天然產(chǎn)物 |
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