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28968058wj新蟲 (小有名氣)
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細(xì)胞實(shí)驗(yàn) | 巨噬細(xì)胞的提取和分離方法之實(shí)踐篇
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原理 · 巨噬細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要細(xì)胞成分，具有抗感染、抗腫瘤和參與免疫應(yīng)答、免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)功能。腹腔巨噬細(xì)胞多游離存在于腹水中易于獲得。因此，可以通過向小鼠腹腔內(nèi)注射刺激物制造無菌炎癥環(huán)境以積聚巨噬細(xì)胞，來進(jìn)行巨噬細(xì)胞研究。以下為具體實(shí)驗(yàn)方案。 · 檢測步驟 · 01 材料 昆明小鼠，SPF級，體質(zhì)量18～22 g，雄性，6～8周齡。 02 肉湯制備 6%淀粉肉湯制備 將1.0g胰蛋白胨、0.3g牛肉浸膏和0.5g氯化鈉放入盛有100 mL雙蒸水的燒杯中，置于磁力攪拌器常溫溶解后121℃滅菌30min，于4℃保存。 3%巰基乙酸鹽肉湯的制備 1L雙蒸水中加入29g巰基乙酸鹽，煮沸使其完全溶解，玻璃瓶或離心管分裝后121℃滅菌15min，4℃保存，使用前確保已經(jīng)冷卻。 03 巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo) 每次腹腔注射3%巰基乙酸鹽肉湯1mL，每天1次，3d后用預(yù)冷PBS灌洗腹腔2次。 04 巨噬細(xì)胞的收集 準(zhǔn)備75%乙醇，以脫頸方式處死小鼠，浸泡3min。取出，置于無菌操作臺，仰臥位固定小鼠，右手持注射器于右下腹部將針頭刺入皮下進(jìn)入腹腔，將5mL預(yù)冷的PBS(培養(yǎng)液組為5mL預(yù)冷的10%血清ＲPMI 1640培養(yǎng)液) 注入腹腔，按摩小鼠腹部5min。無菌條件下剪開小鼠腹部皮膚顯露胸腹部，用無菌止血鉗提起劍突處組織，無菌剪刀在該處剪開約1mm2小口。注意止血鉗保持提起狀態(tài)，用無菌巴氏吸管從腹腔開口深入腹腔，反復(fù)沖洗腹膜腔灌洗液2次，可回收約8mL 淡黃色灌洗液。 05 巨噬細(xì)胞的純化與培養(yǎng) 將每只小鼠的灌洗液于常溫條件下1000r /min 離心10min，所得細(xì)胞沉淀用ＲPMI 1640培養(yǎng)液重懸接種，培養(yǎng)體系于37℃靜置培養(yǎng)2～3h后洗去未貼壁細(xì)胞，余下的貼壁細(xì)胞即為巨噬細(xì)胞。 06 巨噬細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及計(jì)數(shù) 細(xì)胞貼壁培養(yǎng)24h后在倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)。用0.5%胰酶消化細(xì)胞，離心棄上清液，PBS重懸得到細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)每只小鼠腹腔中分離的巨噬細(xì)胞數(shù)量。 07 臺盼藍(lán)染色檢測巨噬細(xì)胞活性 將500μL“1.6中”的各組巨噬細(xì)胞懸液和500μL臺盼藍(lán)染液(0.4%濃度) 加入3.5cm培養(yǎng)皿，搖勻后靜置3～8min; 吸取1滴混合液滴入載玻片，3min內(nèi)鏡下計(jì)數(shù)巨噬細(xì)胞200個，分別統(tǒng)計(jì)活/死細(xì)胞數(shù)目(死細(xì)胞呈藍(lán)色，活細(xì)胞無色透亮) ; 細(xì)胞活性(%) = 活細(xì)胞數(shù)/200×100%。每組檢測重復(fù)3次。 · 注意事項(xiàng) · 小鼠腹腔注射刺激物時不要刺破內(nèi)臟，可以在操作過程中將小鼠頭部向下抓取，使其腹部內(nèi)容物滑向膈下以避開注射器針頭; 若回收的小鼠腹腔灌洗液過少，可另外注入預(yù)冷的PBS重復(fù)灌洗；若不小心致腹腔出血，可在腹腔液離心后重懸時加入5倍細(xì)胞懸液體積的紅細(xì)胞裂解液，再次離心棄上層紅色液體。 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
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