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反對(duì)派銀蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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[求助]
逆轉(zhuǎn)錄結(jié)束后,為何要滅活逆轉(zhuǎn)錄酶?
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invitrogen公司的M-MLV Reverse Transcriptase進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄疑問(wèn): 1. 程序上的問(wèn)題。37℃ 2min→25℃ 10min→37℃ 50min。 中間這個(gè)25℃是起什么作用? 2. 反應(yīng)結(jié)束后為何要70 ℃,15分鐘將逆轉(zhuǎn)錄酶滅活。 3.逆轉(zhuǎn)錄這一步的的成分里面哪些東西會(huì)影響后續(xù)的 qPCR? |
金蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
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一般逆轉(zhuǎn)錄時(shí)用的隨機(jī)引物才會(huì)25度。逆轉(zhuǎn)錄酶特別是mmlv還有末端轉(zhuǎn)移酶活性,可能會(huì)在合成的cDNA末端添加堿基c詳細(xì)可以參考smart。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的離子,殘留引物都可能影響后續(xù)擴(kuò)增,所以一般下一步做PCR的話,逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物最好不要超過(guò)PCR反應(yīng)體系十分之一。 發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶端 |
金蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
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關(guān)于要滅活逆轉(zhuǎn)錄酶活性還有一個(gè)重要原因可能是RT競(jìng)爭(zhēng)性抑制DNA pol,推測(cè)是影響DNA pol結(jié)合到cDNA模板。 發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶端 |
銀蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
銀蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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