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反對派銀蟲 (正式寫手)
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逆轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，為何要滅活逆轉(zhuǎn)錄酶？
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invitrogen公司的M-MLV Reverse Transcriptase進行逆轉(zhuǎn)錄疑問： 1. 程序上的問題。37℃ 2min→25℃ 10min→37℃ 50min。 中間這個25℃是起什么作用？ 2. 反應(yīng)結(jié)束后為何要70 ℃，15分鐘將逆轉(zhuǎn)錄酶滅活。 3.逆轉(zhuǎn)錄這一步的的成分里面哪些東西會影響后續(xù)的 qPCR? |
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一般逆轉(zhuǎn)錄時用的隨機引物才會25度。逆轉(zhuǎn)錄酶特別是mmlv還有末端轉(zhuǎn)移酶活性，可能會在合成的cDNA末端添加堿基c詳細可以參考smart。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的離子，殘留引物都可能影響后續(xù)擴增，所以一般下一步做PCR的話，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物最好不要超過PCR反應(yīng)體系十分之一。 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
2樓2022-10-01 23:21:06
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關(guān)于要滅活逆轉(zhuǎn)錄酶活性還有一個重要原因可能是RT競爭性抑制DNA pol，推測是影響DNA pol結(jié)合到cDNA模板。 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
反對派3樓2022-10-02 08:42:27
反對派
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4樓2022-10-02 12:18:41
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5樓2023-01-07 11:43:47
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