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青椒之路

銅蟲 (正式寫手)

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蟲號(hào): 30599487
注冊(cè): 2022-08-15
專業(yè): 微生物學(xué)

[交流] 酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)熒光蛋白效果還不錯(cuò) 已有1人參與

2、畢氏酵母PEG1000轉(zhuǎn)化法
(1)試劑
緩沖液A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35(sigma),3%(v/v)ethylene glycol
緩沖液B：40%(w/v)PEG1000(sigma)，0.2M Bicine，pH8.35
緩沖液C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35
未污染的新鮮、試劑級(jí)DMSO，-70℃保存
注：緩沖液A、B、C均用濾膜過濾，-20℃保存;
將DNA直接加在凍結(jié)的酵母細(xì)胞上是本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵之處(即使在冰上解凍的待轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其攝取外源DNA的能力也在解凍過程中迅速下降;如進(jìn)行多樣品的轉(zhuǎn)化，建議按6樣品/組進(jìn)行);

(2)待轉(zhuǎn)化畢氏酵母的制備
接種環(huán)接種Pachia pastoris于YPD平板，30℃培養(yǎng)2d;
挑取單克隆酵母菌株于10mlYPD培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)過夜;
取步驟2中小量菌液接種到100mlYPD培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，待其OD值從0.1升到0.5～0.8;
室溫下3000g離心收集酵母菌體，50ml緩沖液A洗滌一次;
重懸菌體于4ml緩沖液A中，按0.2ml/管分裝于1.5ml的離心管中，每管加入11ulDMSO，混合后迅速于液氮中冷凍，-70℃保存。

(3)畢氏酵母的轉(zhuǎn)化
將約50ug線性化質(zhì)粒DNA溶于20ul TE或水中，直接加于凍結(jié)的酵母細(xì)胞中;加入擔(dān)體DNA(40ug變性超聲線性化鮭魚精DNA)以獲得最大轉(zhuǎn)化率;
37℃水浴孵育5min，中間混合樣品1～2次;
取出離心管，加入1.5ml緩沖液B，徹底混勻;
30℃水浴孵育1h;
室溫下2000g離心10min，去除上清液，菌體沉淀重懸于1.5ml緩沖液C中;
離心樣品，去除上清液，輕微操作將樣品重懸于0.2ml緩沖液C中;
將所有轉(zhuǎn)化液鋪于選擇性平板，于30℃孵育3～4天后，鑒定;

微信圖片_20220821094842.jpg

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1樓 2022-08-21 09:57:05

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leeds_to

新蟲 (初入文壇)

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專業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能

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小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖

您好，我是研二在讀學(xué)生，課題是利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)驗(yàn)證DNA功能。最近遇到轉(zhuǎn)化問題，想向您請(qǐng)教

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2樓2023-06-13 10:27:49

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