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青椒之路銅蟲 (正式寫手)
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[交流]
酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)熒光蛋白效果還不錯 已有1人參與
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2、畢氏酵母PEG1000轉(zhuǎn)化法 (1)試劑 緩沖液A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35(sigma),3%(v/v)ethylene glycol 緩沖液B：40%(w/v)PEG1000(sigma)，0.2M Bicine，pH8.35 緩沖液C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35 未污染的新鮮、試劑級DMSO，-70℃保存 注：緩沖液A、B、C均用濾膜過濾，-20℃保存; 將DNA直接加在凍結(jié)的酵母細(xì)胞上是本實驗的關(guān)鍵之處(即使在冰上解凍的待轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其攝取外源DNA的能力也在解凍過程中迅速下降;如進(jìn)行多樣品的轉(zhuǎn)化，建議按6樣品/組進(jìn)行); (2)待轉(zhuǎn)化畢氏酵母的制備 接種環(huán)接種Pachia pastoris于YPD平板，30℃培養(yǎng)2d; 挑取單克隆酵母菌株于10mlYPD培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)過夜; 取步驟2中小量菌液接種到100mlYPD培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，待其OD值從0.1升到0.5～0.8; 室溫下3000g離心收集酵母菌體，50ml緩沖液A洗滌一次; 重懸菌體于4ml緩沖液A中，按0.2ml/管分裝于1.5ml的離心管中，每管加入11ulDMSO，混合后迅速于液氮中冷凍，-70℃保存。 (3)畢氏酵母的轉(zhuǎn)化 將約50ug線性化質(zhì)粒DNA溶于20ul TE或水中，直接加于凍結(jié)的酵母細(xì)胞中;加入擔(dān)體DNA(40ug變性超聲線性化鮭魚精DNA)以獲得最大轉(zhuǎn)化率; 37℃水浴孵育5min，中間混合樣品1～2次; 取出離心管，加入1.5ml緩沖液B，徹底混勻; 30℃水浴孵育1h; 室溫下2000g離心10min，去除上清液，菌體沉淀重懸于1.5ml緩沖液C中; 離心樣品，去除上清液，輕微操作將樣品重懸于0.2ml緩沖液C中; 將所有轉(zhuǎn)化液鋪于選擇性平板，于30℃孵育3～4天后，鑒定; 微信圖片_20220821094842.jpg |
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2樓2023-06-13 10:27:49
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