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ZMQ68新蟲 (初入文壇)
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EMSA!!! 已有5人參與
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最近做EMSA，EB染色后DNA片段一直看不到。想請教有經(jīng)驗(yàn)的前輩一些問題�。。。�！ 啟動子必須加探針標(biāo)記嗎？？？很無知無助無力了。。我現(xiàn)在只用了純化后的啟動子片段跟蛋白孵育后跑Native-PAGE，用考馬斯染蛋白有正確條帶，很正常。 但是用EB染色20min紫外照膠卻看不到DNA條帶，不知道什么原因。是不是DNA濃度低，有沒有做相關(guān)的實(shí)驗(yàn)，能否告知一下您的實(shí)驗(yàn)條件參考一下，，不勝感激�。。。�！ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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armigera
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根據(jù)我曾經(jīng)的經(jīng)驗(yàn)，自由探針(未結(jié)合蛋白)是大多數(shù), 結(jié)合的只是少數(shù)。所以你能看到總的dna并不能代表能看到結(jié)合的條帶。以上是我的推測，歡迎一起討論。 我之前用同位素標(biāo)記的，沒有做過未標(biāo)記直接染色的。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
9樓2022-08-05 21:38:35
pennchem
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（1） 探針的濃度夠嗎？ （單獨(dú)跑探針染色能染上嗎） （2） 探針的大�。ㄊ欠裉螅瑳]有進(jìn)入分離膠；是否太小，已經(jīng)跑出去了？） （3） 探針與蛋白結(jié)合的條件是否有利于結(jié)合（鎂離子是否必須，鹽離子濃度超過100mM了嗎？ 緩沖液的pH值是多少？） （4） 在（3）的條件下，探針是否與蛋白結(jié)合（有實(shí)驗(yàn)證據(jù)嗎） （5） 是否有可能存在探針被降解的可能？ （6） 電泳過程是否大量產(chǎn)熱，是否導(dǎo)致蛋白變性，或者復(fù)合物解離？ （7） 一步步做對照試驗(yàn)吧，一個實(shí)驗(yàn)不成功，很難說明哪(幾)個步驟有問題 good luck~ |
2樓2022-08-04 17:43:41
jinvijie
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3樓2022-08-05 00:24:08
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4樓2022-08-05 00:57:56
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