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ZMQ68新蟲 (初入文壇)
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EMSA!!! 已有5人參與
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最近做EMSA，EB染色后DNA片段一直看不到。想請(qǐng)教有經(jīng)驗(yàn)的前輩一些問(wèn)題�。。。�！ 啟動(dòng)子必須加探針標(biāo)記嗎？？？很無(wú)知無(wú)助無(wú)力了。。我現(xiàn)在只用了純化后的啟動(dòng)子片段跟蛋白孵育后跑Native-PAGE，用考馬斯染蛋白有正確條帶，很正常。 但是用EB染色20min紫外照膠卻看不到DNA條帶，不知道什么原因。是不是DNA濃度低，有沒(méi)有做相關(guān)的實(shí)驗(yàn)，能否告知一下您的實(shí)驗(yàn)條件參考一下，，不勝感激�。。。�！ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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（1） 探針的濃度夠嗎？ （單獨(dú)跑探針染色能染上嗎） （2） 探針的大�。ㄊ欠裉�，沒(méi)有進(jìn)入分離膠；是否太小，已經(jīng)跑出去了？） （3） 探針與蛋白結(jié)合的條件是否有利于結(jié)合（鎂離子是否必須，鹽離子濃度超過(guò)100mM了嗎？ 緩沖液的pH值是多少？） （4） 在（3）的條件下，探針是否與蛋白結(jié)合（有實(shí)驗(yàn)證據(jù)嗎） （5） 是否有可能存在探針被降解的可能？ （6） 電泳過(guò)程是否大量產(chǎn)熱，是否導(dǎo)致蛋白變性，或者復(fù)合物解離？ （7） 一步步做對(duì)照試驗(yàn)吧，一個(gè)實(shí)驗(yàn)不成功，很難說(shuō)明哪(幾)個(gè)步驟有問(wèn)題 good luck~ |
2樓2022-08-04 17:43:41
jinvijie
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6樓2022-08-05 15:59:17
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謝謝回帖!! 1.用跑native-page膠制備的體系剩下的混合物跑了一次瓊脂糖凝膠電泳（DNA經(jīng)過(guò)比例稀釋），出現(xiàn)了很淺的一條帶。后續(xù)有重新進(jìn)行擴(kuò)增、產(chǎn)物純化鑒定，目前不確定不加標(biāo)記的探針我采取得濃度一系列操作下來(lái)染色是否可行。此外，在跑非變性膠做對(duì)照時(shí)，只有探針的膠孔染色也是看不見(jiàn)。 2.我采用的是連續(xù)體系，探針大小約250+bp或350bp，我單獨(dú)染蛋白位置大約在蛋白膠的1/3處，溴酚藍(lán)指示劑約在底部1/5處，按道理應(yīng)該沒(méi)有跑出去。電壓100V，約兩小時(shí)。 3.結(jié)合條件，參照文獻(xiàn)設(shè)定，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中沒(méi)有涉及到鎂離子，鹽濃度設(shè)置為50mM，緩沖液PH8。 4.參照文獻(xiàn)探針與蛋白應(yīng)該有結(jié)合，由于一直沒(méi)有染出DNA條帶，因此不確定是實(shí)驗(yàn)方法問(wèn)題，還是操作等問(wèn)題。 5.DNA探針均為新制備，長(zhǎng)時(shí)間可能會(huì)被降解，目前可能性較低。 6.電泳過(guò)程持續(xù)在4度下進(jìn)行，蛋白染色發(fā)現(xiàn)并沒(méi)有變性。7.非常感謝提出地注意事項(xiàng)!!!順便問(wèn)一下DNA探針如果不標(biāo)記是否能做出來(lái)？標(biāo)記是必須的嗎？ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
7樓2022-08-05 16:13:41
ZMQ68
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根據(jù)我曾經(jīng)的經(jīng)驗(yàn)，自由探針(未結(jié)合蛋白)是大多數(shù), 結(jié)合的只是少數(shù)。所以你能看到總的dna并不能代表能看到結(jié)合的條帶。以上是我的推測(cè)，歡迎一起討論。 我之前用同位素標(biāo)記的，沒(méi)有做過(guò)未標(biāo)記直接染色的。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
9樓2022-08-05 21:38:35
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10樓2022-10-20 09:21:29
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