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draxlx新蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
構(gòu)建且成功表達(dá)過(guò)的重組質(zhì)粒 復(fù)測(cè)數(shù)據(jù)時(shí)不表達(dá)了 已有1人參與
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各位大佬，誠(chéng)心求助。 4月份的時(shí)候，我用無(wú)縫克隆技術(shù)構(gòu)建了一個(gè) "目的基因+耐熱基因+表達(dá)載體" 的重組質(zhì)粒 ，成功表達(dá)了“目的基因+耐熱基因”的融合蛋白，測(cè)其酶學(xué)特性顯示 ：融合蛋白比野生酶在溫度穩(wěn)定性方面有了極大改善。 現(xiàn)在7月份，我用當(dāng)初保藏的菌種 再次擴(kuò)培、破胞、純化，復(fù)測(cè)其溫度穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)與野生酶一樣，重復(fù)不出當(dāng)初的數(shù)據(jù)。 跑過(guò)菌液電泳，確實(shí)是重組質(zhì)粒的菌液沒(méi)有拿錯(cuò)。 又跑了蛋白膠，結(jié)果沒(méi)有融合蛋白的表達(dá)條帶，反而有野生酶的表達(dá)條帶。（怪不得復(fù)測(cè)的時(shí)候，融合蛋白與野生酶的數(shù)據(jù)幾乎一模一樣，差別十分微小） 有沒(méi)有朋友出現(xiàn)過(guò)這種情況��？ （4月份所測(cè)的數(shù)據(jù)是沒(méi)有錯(cuò)的，因?yàn)楫?dāng)時(shí)短時(shí)間內(nèi)有3個(gè)人都測(cè)了，三個(gè)人測(cè)出來(lái)的數(shù)據(jù)是高度統(tǒng)一的。） |
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2樓2022-07-29 13:03:58
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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現(xiàn)在是表達(dá)蛋白大小不對(duì)了，最優(yōu)先的任務(wù)是重新構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，重復(fù)之前的結(jié)果吧？ 另：跑過(guò)菌液電泳，確實(shí)是重組質(zhì)粒的菌液沒(méi)有拿錯(cuò)， 這個(gè)跑的是質(zhì)粒電泳，還是蛋白電泳？(如果是蛋白電泳，那應(yīng)該是蛋白純化過(guò)程中水解了；如果是質(zhì)粒電泳，那蛋白在表達(dá)過(guò)程中可能就水解了） 這樣的事情是怎么發(fā)生的？ 可能性太多了，拿錯(cuò)了，污染了，linker被水解了。 |
3樓2022-07-29 16:46:09
draxlx
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謝謝您的回答。 已經(jīng)試過(guò)將當(dāng)初保存的質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化后表達(dá)，蛋白膠結(jié)果顯示有融合蛋白條帶出現(xiàn)，但是表達(dá)量非常小，且依舊有本不該出現(xiàn)的野生酶表達(dá)條帶。 現(xiàn)在準(zhǔn)備重新再構(gòu)建一次質(zhì)粒試試。 菌液電泳跑的是質(zhì)粒電泳。我現(xiàn)在不明白的主要是 為什么野生酶依舊有表達(dá)呢，當(dāng)初構(gòu)建重組質(zhì)粒的時(shí)候用的是無(wú)縫克隆，終止密碼子、酶切位點(diǎn)等全都去掉了，將兩個(gè)基因“無(wú)縫”地連在一起，如果是蛋白表達(dá)有問(wèn)題，那也應(yīng)該是全部不表達(dá)。 |
4樓2022-07-31 13:39:34
draxlx
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5樓2022-07-31 13:42:25
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沒(méi)必要重新構(gòu)載體的，每次搖菌的表達(dá)量都會(huì)不一樣。要穩(wěn)定的表達(dá)，直接低溫誘導(dǎo)就好了 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶端 |
6樓2022-07-31 14:21:01
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