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guying03鐵桿木蟲 (小有名氣)
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RNA生物農(nóng)藥技術(shù)層面需要解決的問題
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RNA生物農(nóng)藥技術(shù)層面需要解決的問題 依據(jù)目前的研發(fā)進(jìn)度，RNA生物農(nóng)藥極有可能在未來幾年上市。目前來看，RNA生物農(nóng)藥在技術(shù)層面上還有一些問題需要解決。 高效RNAi靶標(biāo)基因的篩選 RNA生物農(nóng)藥優(yōu)勢之一是利用低劑量dsRNA即能夠引起高效RNAi效應(yīng)，因此，獲得目標(biāo)生物高效致死的RNAi靶標(biāo)基因是研制RNA生物農(nóng)藥的關(guān)鍵。 目前對(duì)于靶標(biāo)基因的篩選和獲得，可以通過（1）已知的病蟲生長發(fā)育過程中的關(guān)鍵基因，作為可能的靶標(biāo)基因進(jìn)行篩選；（2）通過相近物種中已知的高效靶標(biāo)基因的同源序列基因進(jìn)行篩選；（3）通過測序技術(shù)，對(duì)病蟲不同組織、不同發(fā)育階段基因進(jìn)行研究和篩選，從而獲得高效致死作用的靶標(biāo)基因。 目前，通過這些方式，已經(jīng)獲得多個(gè)重要害蟲的靶標(biāo)基因。但是，在篩選靶標(biāo)基因的同時(shí)，也發(fā)現(xiàn)不同種類昆蟲RNAi效率不同。比如，相比于鞘翅目、直翅目昆蟲來說，鱗翅目昆蟲RNAi效率較低，高效致死作用的靶標(biāo)基因篩選也相對(duì)困難。這可能是由于昆蟲自身特異基因、中腸環(huán)境、RNAi通路機(jī)制存在差異而導(dǎo)致的結(jié)果。那么，在針對(duì)這類昆蟲靶標(biāo)基因篩選時(shí)，就需要綜合考慮。由于同一靶標(biāo)基因在不同物種中行使的功能并不完全一致、不同作用機(jī)制的靶標(biāo)基因可能產(chǎn)生抗性程度存在差異、不同物種中RNAi作用機(jī)制存在差異，而且都是影響靶標(biāo)基因作用效果的重要因素，因此，在選擇靶標(biāo)基因的過程中均需考慮。 dsRNA的生產(chǎn)成本 dsRNA的合成成本是RNA生物農(nóng)藥能否在田間施用的至關(guān)重要的因素。合成dsRNA的方式，主要包括化學(xué)合成、體外合成以及微生物發(fā)酵合成3種方式。 化學(xué)合成成本高，并且隨著dsRNA合成長度的增加，合成錯(cuò)誤率增加，一般僅適用于實(shí)驗(yàn)室研究的小劑量使用，而不適合大規(guī)模生產(chǎn)。 體外無細(xì)胞系統(tǒng)的合成方式主要通過表達(dá)dsRNA的元件，之后通過對(duì)合成體系進(jìn)行調(diào)整優(yōu)化，進(jìn)行體外合成并純化。目前，針對(duì)于這種合成方法，美國的Greenlight Biosciences公司研發(fā)了無細(xì)胞合成體系，能夠?qū)sRNA的合成成本控制在1美元/g以內(nèi)，其成本已經(jīng)能夠滿足田間規(guī)�；瘧�(yīng)用的要求（https://greenlightbiosciences.com/）。 利用微生物發(fā)酵表達(dá)合成dsRNA也是目前可能規(guī)�；瘧�(yīng)用的方式之一。已經(jīng)在包括大腸桿菌（Escherichia coli）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）在內(nèi)的多種底盤細(xì)胞中構(gòu)建并得到合成dsRNA的菌株，通過提取微生物發(fā)酵產(chǎn)物或者將微生物滅活后，處理相關(guān)的靶標(biāo)生物，均能夠產(chǎn)生相應(yīng)的RNAi表型。例如加拿大Renaissance BioScience Corp公司通過專屬的酵母載體表達(dá)dsRNA，飼喂馬鈴薯甲蟲，能夠精準(zhǔn)地抑制靶標(biāo)基因的表達(dá)，并且對(duì)馬鈴薯甲蟲致死率高達(dá)98.3%，達(dá)到保護(hù)植株的功效（https://renaissancebioscience.com/）。 dsRNA的穩(wěn)定性 dsRNA屬于核酸類物質(zhì)，在復(fù)雜的大田環(huán)境（pH、光照、雨水、微生物等）中或者存在核酸酶的情況下，極其容易發(fā)生降解。因此，RNA生物農(nóng)藥的穩(wěn)定性及貨架期對(duì)于RNA生物農(nóng)藥產(chǎn)品的開發(fā)至關(guān)重要。目前，已經(jīng)有多種手段提高dsRNA的穩(wěn)定性。例如，通過納米包被，顯著提高dsRNA的穩(wěn)定性；通過BioClay的包被，能夠顯著提高dsRNA在葉片上的存在時(shí)長，增加噴灑型dsRNA的作用效率。同時(shí)，也有多家公司專門開展針對(duì)于dsRNA穩(wěn)定性的各種助劑以及納米顆粒研發(fā)，結(jié)果顯示，添加各種輔助產(chǎn)品后顯著增加dsRNA在環(huán)境及靶標(biāo)生物體內(nèi)的穩(wěn)定性。 其他需要解決的問題 除了上述幾個(gè)主要問題之外，RNA生物農(nóng)藥的遞送效率，RNA生物農(nóng)藥在進(jìn)行環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估時(shí)殘留量的檢測手段等等都是RNA生物農(nóng)藥應(yīng)用之前亟需解決的關(guān)鍵問題。隨著科研機(jī)構(gòu)、相關(guān)企業(yè)以及投資機(jī)構(gòu)對(duì)該領(lǐng)域的進(jìn)一步深耕，相信這些問題能夠迎刃而解，從而推動(dòng)RNA生物農(nóng)藥的早日推廣使用。 RNA生物農(nóng)藥的環(huán)境評(píng)估及政策層面需要解決的問題 RNA生物農(nóng)藥能否早日實(shí)現(xiàn)商業(yè)化應(yīng)用，除了技術(shù)層面的問題之外，還面臨著可能的環(huán)境及政策層面需要解決的問題。 RNA生物農(nóng)藥獲得農(nóng)藥許可證書之前，需要進(jìn)行環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。主要包括評(píng)估應(yīng)用過程中釋放的dsRNA在環(huán)境中的存在及降解情況，對(duì)于非靶標(biāo)物種的影響，以及對(duì)于人類健康存在的可能風(fēng)險(xiǎn)。進(jìn)行殘留檢查時(shí)，就需要運(yùn)用合適的技術(shù)手段進(jìn)行痕量dsRNA殘留的檢測。 對(duì)于dsRNA含量的檢測，目前在實(shí)驗(yàn)室條件下主要采用分光光度計(jì)、瓊脂糖凝膠電泳及PCR進(jìn)行檢測，需要相對(duì)專業(yè)的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。同時(shí)，由于不同檢測方法的靈敏度存在一定差異，因此需要研發(fā)針對(duì)環(huán)境中的痕量dsRNA，進(jìn)行簡便、快速、高靈敏度的檢測方法。目前，通過放射性同位素32P標(biāo)記的方法，可以顯著提高檢測環(huán)境中dsRNA的靈敏度。 其次，對(duì)于非靶標(biāo)物種的影響。除了采用傳統(tǒng)的急性及慢性毒理檢測手段之外，根據(jù)RNAi的作用機(jī)制，dsRNA僅對(duì)能夠良好匹配的目標(biāo)mRNA產(chǎn)生抑制作用。那么，能否利用生物信息學(xué)手段，對(duì)非靶標(biāo)物種的整個(gè)基因組序列進(jìn)行分析，預(yù)測目標(biāo)dsRNA可能對(duì)于非靶標(biāo)物種的影響，這種檢測的可信度有多高，能否作為一種技術(shù)手段或者作為一種參考應(yīng)用于RNA生物農(nóng)藥的環(huán)境毒理檢測，也是需要深入探討的重要問題。 文章來源： 關(guān)若冰，李海超，苗雪霞，RNA生物農(nóng)藥的商業(yè)化現(xiàn)狀及存在問題，中國農(nóng)業(yè)科學(xué) |
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