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貓喝可樂鐵蟲 (初入文壇)
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[求助]
qPCR問題求助
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想麻煩各位科研大佬幫忙看一下， 科研小白剛開始做qPCR差不多一個月， 也已經(jīng)跑出來過一些氮循環(huán)相關(guān)的基因如：noszⅠ、noszⅡ、nirK等， 目前在做的基因是amoA的古菌，但是遇到了一些問題解決不了， 已經(jīng)做過多次重復(fù)實驗，且qPCR程序是用之前師兄師姐設(shè)置好的， 且質(zhì)粒和引物也是之前師兄師姐使用后沒問題的（能跑出來）， 目前的情況如下： 1、酶是takara的、引物是amoAF和amoAR這一對、稀釋質(zhì)粒是用的east dilution。 2、之前用AG的酶跑過，和Takara的情況一樣效率很高但雜帶很多。 3、考慮過是酶失活，但改進后無變化；考慮引物不是一對，改進后無變化。 4、考慮引物濃度太高導(dǎo)致非特異性擴增，跑pcr后發(fā)現(xiàn)條帶較為單一，有不明顯的引物二聚體。 5、在實驗過程中的試管、水、槍頭等均是滅菌干凈的，且在無菌的通風(fēng)櫥中進行操作。 6、目前是質(zhì)粒在擴增以后仍是非單一主峰，且樣品也存在類似情況（如下圖-左側(cè)3列質(zhì)粒、右側(cè)3列樣品），故考慮應(yīng)該不是單純的質(zhì)粒問題。 7、發(fā)現(xiàn)稀釋質(zhì)粒在稀釋倍數(shù)比較低的時候（稀釋10、100、1000倍）溶解曲線的峰形單一且明顯，但隨稀釋倍數(shù)增加出現(xiàn)非單一峰 8、樣品基因豐度約在稀釋質(zhì)粒的3次方到5次方之間，且Takara的效率約在95-110之間。 p.s.下面為實驗的結(jié)果，麻煩各位大佬看看有什么問題，萬分感謝！ https://i.postimg.cc/kDP5F2cZ/20220406094707.jpg |
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3樓2022-04-21 16:00:12
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