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ArthurFSun鐵蟲 (小有名氣)
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[交流]
293細(xì)胞生產(chǎn)重組蛋白，上清中檢測不到 已有3人參與
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大家好， 請教一個(gè)問題。 最近我在用293F細(xì)胞表達(dá)帶HIS標(biāo)簽的重組蛋白。培養(yǎng)體系是600 mL。我發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染36小時(shí)后，用western blot和免疫熒光可在細(xì)胞內(nèi)檢測到有目的蛋白表達(dá)。但在轉(zhuǎn)染后24-120 h的任何時(shí)間點(diǎn)，在上清中用 western blot卻檢測不到目的蛋白。用超濾管將上清濃縮10倍，western blot仍然檢測不到目的蛋白。將轉(zhuǎn)染后36h的上清掛鎳柱，洗脫時(shí)沒有出現(xiàn)目的蛋白峰。 請問，（1）上清中檢測不到蛋白可以能什么原因？是因?yàn)榈鞍撞环置趩�？蛋白帶有天然信號肽，理論上是�?yīng)該分泌的。western blot檢測不到是因?yàn)榉置诹刻蛦�？擴(kuò)大培養(yǎng)體系有可能檢測的蛋白嗎？ （2）我用的培養(yǎng)基的廠家說明書推薦細(xì)胞培養(yǎng)5天后收獲培養(yǎng)基純化蛋白，但是我發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)已經(jīng)變暗，細(xì)胞數(shù)目也開始下降。請問有經(jīng)驗(yàn)的前輩，293F細(xì)胞表達(dá)蛋白時(shí)，細(xì)胞密度多大時(shí)開始轉(zhuǎn)染？轉(zhuǎn)染后一般培養(yǎng)幾天后開始純化蛋白？ 謝謝！ |
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2樓2022-05-24 13:39:07
Arp熱愛SC
鐵蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 18.5
- 帖子: 2
- 在線: 5.3小時(shí)
- 蟲號: 14968414
- 注冊: 2019-04-27
- 性別: GG
- 專業(yè): 抗體工程學(xué)
3樓2023-03-26 20:49:43
★
小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
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Polycystine-poly(His,Arg)1:5 (CHR) transfection of CHO-DG44 cells for the production of recombinant IgG antibody CHO-DG44 cells, CHO-K1 cells and MEFs CHR is composed of 100% amino acids,without any cytotoxic PEI. CHR-mediated transfection does not require complexpre-formation, works well in serum-containing media and is biodegradable, which may prevent cumulative cytotoxicity and facilitates downstream processing. |
4樓2023-04-01 13:05:51
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