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醫(yī)學(xué)生物科研銅蟲 (小有名氣)
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【技術(shù)分享】熒光原位雜交技術(shù)全攻略
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原位雜交（in situ hybridization）是指將特定標(biāo)記的已知順序核酸為探針與細(xì)胞或組織切片中核酸進(jìn)行雜交，從而對(duì)特定核酸順序進(jìn)行精確定量定位的過程。基本原理是兩條核苷酸單鏈片段，在適宜的條件下，能過氫鍵結(jié)合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或 RNA-RNA 雙鍵分子的特點(diǎn)，應(yīng)用帶有標(biāo)記的（放射性同位素、熒光素生物素、地高辛等非放射性物質(zhì)）DNA或RNA片段作為核酸探針，與組織切片或細(xì)胞內(nèi)待測(cè)核酸（RNA或DNA）片段進(jìn)行雜交，然后可用放射自顯影等方法予以顯示，在光鏡或電鏡下觀察目的 mRNA或DNA 的存在并定位。 熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）是以熒光標(biāo)記取代同位素標(biāo)記而形成的一種原位雜交方法。因?yàn)椴恍枰派湫酝凰貥?biāo)記，因此經(jīng)濟(jì)安全；還可以通過不同標(biāo)記的探針，在同一個(gè)樣品中同時(shí)檢測(cè)多種序列。 熒光原位雜交探針的熒光標(biāo)記可以采用直接和間接標(biāo)記的方法。間接標(biāo)記是采用生物素標(biāo)記DNA探針，雜交之后用熒光素親和素或者鏈霉親和素進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)還可以利用親和素-生物素-熒光素復(fù)合物，將熒光信號(hào)進(jìn)行放大；直接標(biāo)記法是將熒光素直接與探針核苷酸或磷酸戊糖骨架共價(jià)結(jié)合，或在缺口平移法標(biāo)記探針時(shí)將熒光素核苷三磷酸摻入。直接標(biāo)記法檢測(cè)步驟簡(jiǎn)單，但由于不能進(jìn)行信號(hào)放大，因此靈敏度不如間接標(biāo)記的方法。 原位雜交探針分類 染色體特異重復(fù)序列探針，主要用于檢測(cè)染色體數(shù)目異常； 全染色體或染色體區(qū)域特異性探針，主要用于檢測(cè)染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常； 特異性位置探針，用于檢測(cè)染色體的易位、缺失等。此外，還有用于特定RNA檢測(cè)的人工合成或體外轉(zhuǎn)錄的探針。 熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)的步驟 探針變性：將探針在75℃恒溫水浴中溫育5min，立即置0℃，5～10min，使雙鏈DNA探針變性。 切片置于65℃下過夜烘烤。 二甲苯中室溫脫蠟2次，每次10分鐘，隨后浸入100%乙醇中5分鐘。 切片依次室溫置于100％乙醇、85％乙醇和70％乙醇中各兩分鐘復(fù)水。將組織切片室溫浸入去離子水中3分鐘，用無絨紙巾吸取多余的水分。 50℃下用30%酸性亞硫酸鈉（sodium bisulfite ）處理組織切片20－30分鐘。 于2XSSC溶液中漂洗2次，每次5分鐘。 取0.4ml蛋白酶K儲(chǔ)存液（20mg/ml）溶于40ml 20XSSC(pH 7.0)得到蛋白酶K工作液（200μg/ml）；將組織切片浸泡在蛋白酶K工作液中，37℃下孵育20-30分鐘。 組織切片經(jīng)蛋白酶K消化后，于2XSSC溶液中漂洗2次，每次5分鐘。 將組織切片置于0.1M HCl中室溫浸泡5-10分鐘，于2XSSC溶液中漂洗2次，每次5分鐘。 將組織切片玻片依次置于-20℃預(yù)冷的70%乙醇、85％乙醇和100％乙醇中各2分鐘脫水。 將組織切片室溫浸入丙酮溶液中2分鐘。 自然干燥玻片，加熱玻片至56℃。 將已變性或預(yù)退火的探針10 μL 滴于已變性并脫水的玻片標(biāo)本上，蓋上18×18蓋玻片，用Parafilm封片，置于潮濕暗盒中37℃雜交過夜（為防止雜交液蒸發(fā)，此過程在濕盒中進(jìn)行）。 將已雜交的玻片標(biāo)本放置于已預(yù)熱42～50℃的體積分?jǐn)?shù)50%甲酰胺/2×SSC中洗滌3次，每次5 min。 在已預(yù)熱42～50℃的1×SSC中洗滌3次，每次5 min。 自然干燥玻片，DAPI復(fù)染。 熒光顯微鏡觀察結(jié)果。 |
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