 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 5 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 1875 | 回復(fù): 5 | ||
| 【懸賞金幣】回答本帖問題，作者Tiancccccc將贈(zèng)送您 5 個(gè)金幣 | ||
| 當(dāng)前只顯示滿足指定條件的回帖，點(diǎn)擊這里查看本話題的所有回帖 | ||
Tiancccccc鐵蟲 (小有名氣)
|
[求助]
selex篩選核酸適配體，pcr擴(kuò)增后產(chǎn)率極低
|
|
 各位大佬求指導(dǎo) ! ! !期待大家廣泛討論 問題：我采用磁珠法篩選適配體，但是得到的目的產(chǎn)物量極少，無法開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。二次擴(kuò)增會(huì)放大擴(kuò)增偏好，所以還是想只擴(kuò)增一次，提高PCR產(chǎn)率。 大致篩選情況如下：我采用羧基磁珠偶聯(lián)目標(biāo)蛋白，然后與76 nt的DNA文庫(kù)（5’-TTCAGCACTCCAGGCATAGC-N(36)-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’ ）孵育，洗脫未結(jié)合的文庫(kù)，加入200 uL pH 7.4的hepes溶液（20 mM HEPES, 0.05 M NaCl, 2 mM CaCl2, pH 7.4）煮沸磁珠，使文庫(kù)變性脫落到溶液中，將溶液用于PCR擴(kuò)增，pcr擴(kuò)增程序設(shè)置為：step 1，95 ℃, 3 minstep 2，95 ℃, 30 s；60 ℃, 30 s；72 ℃, 30 sstep 3，Go to step 2 for 34 cyclesstep 4，72 ℃， 5 minstep 5，4 ℃，forever（pcr之前做過QPCR，計(jì)算出擴(kuò)增效率正常）另外，大概是因?yàn)閿U(kuò)增次數(shù)過多，產(chǎn)生的非特異性條帶也很多。 完后，正丁醇濃縮PCR產(chǎn)物體積至100 uL左右，采用10% denaturing PAGE gel分離目的條帶，切膠，elution buffer提取，正丁醇濃縮，乙醇沉淀，真空旋干，最終得到約2 ug的產(chǎn)物（文庫(kù)），難以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 個(gè)人設(shè)想會(huì)不會(huì)是篩選緩沖液影響（試過投入相同量的DNA模板，buffer用水，但也沒有提高多少產(chǎn)率），模板投入量提高后產(chǎn)率略有提高，或者煮沸液中含有pcr抑制劑（QPCR的Ct值在11輪左右，感覺可以排除這個(gè)原因）后續(xù)打算用原始文庫(kù)擴(kuò)增試一下，看產(chǎn)率是否提高，再次排除抑制劑的影響。或者每一輪的pcr都需要進(jìn)行條件優(yōu)化嗎，關(guān)于退火時(shí)間，溫度，循環(huán)數(shù)。擴(kuò)增循環(huán)數(shù)增加，非特異性條帶增多會(huì)導(dǎo)致目的產(chǎn)物變少嗎？剛接觸到適配體篩選以及PCR這些技術(shù)，還挺懵的，請(qǐng)大家指導(dǎo)一下。 真心期待大家一起討論，感謝大佬相助 |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：實(shí)驗(yàn)器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：和實(shí)驗(yàn)材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤(rùn)色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有265人回復(fù)
-
蛋白質(zhì)檢測(cè)：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之小鼠實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)，解析生命機(jī)制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測(cè)：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測(cè)重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
Tiancccccc
鐵蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 58.9
- 帖子: 57
- 在線: 13.9小時(shí)
- 蟲號(hào): 24817439
- 注冊(cè): 2020-12-23
- 專業(yè): 藥物學(xué)其他科學(xué)問題
4樓2021-10-19 13:29:52
今天PCR了
新蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 44.8
- 帖子: 11
- 在線: 2.9小時(shí)
- 蟲號(hào): 24599125
- 注冊(cè): 2020-11-19
- 專業(yè): 生物物理、生物化學(xué)與分子
2樓2021-10-12 15:59:29
yubeihong
鐵桿木蟲 (職業(yè)作家)
- 應(yīng)助: 20 (小學(xué)生)
- 金幣: 7537.3
- 散金: 605
- 紅花: 40
- 帖子: 3051
- 在線: 641小時(shí)
- 蟲號(hào): 253258
- 注冊(cè): 2006-05-20
- 性別: GG
- 專業(yè): 生物化工與食品化工
3樓2021-10-15 22:49:46
fei1998315
新蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 40.3
- 帖子: 9
- 在線: 4.2小時(shí)
- 蟲號(hào): 27955080
- 注冊(cè): 2021-12-14
- 專業(yè): 免疫學(xué)
5樓2022-04-26 10:17:10
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 0817化學(xué)工程與技術(shù)312分求調(diào)劑 +6 | T123 tt 2026-03-04 | 6/300 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 346分材料求調(diào)劑 +3 | snow_反季節(jié)版 2026-03-07 | 3/150 |
|
|
|
[考研]
 調(diào)劑的同學(xué)，走過路過，不要錯(cuò)過
+5
|
likeihood 2026-03-06 | 9/450 |
|
|
[考研] 一志愿山東大學(xué)105500藥學(xué)專碩，總分302求調(diào)劑 +4 | 五維天空 2026-03-04 | 9/450 |
|
|
|
[基金申請(qǐng)] 進(jìn)入個(gè)人成果庫(kù)好難，一下午都沒進(jìn)去 +5 | mi_dilee 2026-03-05 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 306求調(diào)劑 +7 | Bahati 2026-03-05 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 301求調(diào)劑 +7 | 朝天椒的雙馬尾 2026-03-05 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 08工科求調(diào)劑 +3 | 隆LLL 2026-03-06 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 不限學(xué)校專業(yè)的調(diào)劑同學(xué)看過來 +5 | 啊擺啊擺 2026-03-05 | 9/450 |
|
|
|
[考博] 2026申博自薦 六級(jí)440電催化方向 +4 | 櫻落成影花成雙 2026-03-05 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 一志愿清華深研院材料專碩294分，專業(yè)課111分，本科中南大學(xué)材料，有六級(jí)，有工作經(jīng)驗(yàn) +3 | H14528 2026-03-04 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué) 學(xué)碩 理工科均可 不區(qū)分研究方向 總分279求調(diào)劑 +7 | 1一11 2026-03-03 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 0855機(jī)械工程324求調(diào)劑 +3 | 鄭SK 2026-03-02 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 281求調(diào)劑 +3 | 我是小小蔥蔥 2026-03-03 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 347分電子信息專碩求調(diào)劑 +3 | 咕嘟咕嘟1 2026-03-03 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 264求調(diào)劑 +3 | thext 2026-03-03 | 3/150 |
|
|
|
[考研]
 0703化學(xué)學(xué)碩 288分
+4
|
旅行中的紫葡萄 2026-03-03 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 298求調(diào)劑 +3 | 人間唯你是清歡 2026-03-03 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 338求調(diào)劑 +5 | 18162027187 2026-03-02 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 1 +5 | 2026計(jì)算機(jī)_誠(chéng)心 2026-03-01 | 8/400 |
|