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| 【懸賞金幣】回答本帖問題，作者Tiancccccc將贈(zèng)送您 5 個(gè)金幣 | |||
Tiancccccc鐵蟲 (小有名氣)
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[求助]
selex篩選核酸適配體，pcr擴(kuò)增后產(chǎn)率極低
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 各位大佬求指導(dǎo) ! ! !期待大家廣泛討論 問題：我采用磁珠法篩選適配體，但是得到的目的產(chǎn)物量極少，無法開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。二次擴(kuò)增會(huì)放大擴(kuò)增偏好，所以還是想只擴(kuò)增一次，提高PCR產(chǎn)率。 大致篩選情況如下：我采用羧基磁珠偶聯(lián)目標(biāo)蛋白，然后與76 nt的DNA文庫（5’-TTCAGCACTCCAGGCATAGC-N(36)-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’ ）孵育，洗脫未結(jié)合的文庫，加入200 uL pH 7.4的hepes溶液（20 mM HEPES, 0.05 M NaCl, 2 mM CaCl2, pH 7.4）煮沸磁珠，使文庫變性脫落到溶液中，將溶液用于PCR擴(kuò)增，pcr擴(kuò)增程序設(shè)置為：step 1，95 ℃, 3 minstep 2，95 ℃, 30 s；60 ℃, 30 s；72 ℃, 30 sstep 3，Go to step 2 for 34 cyclesstep 4，72 ℃， 5 minstep 5，4 ℃，forever（pcr之前做過QPCR，計(jì)算出擴(kuò)增效率正常）另外，大概是因?yàn)閿U(kuò)增次數(shù)過多，產(chǎn)生的非特異性條帶也很多。 完后，正丁醇濃縮PCR產(chǎn)物體積至100 uL左右，采用10% denaturing PAGE gel分離目的條帶，切膠，elution buffer提取，正丁醇濃縮，乙醇沉淀，真空旋干，最終得到約2 ug的產(chǎn)物（文庫），難以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 個(gè)人設(shè)想會(huì)不會(huì)是篩選緩沖液影響（試過投入相同量的DNA模板，buffer用水，但也沒有提高多少產(chǎn)率），模板投入量提高后產(chǎn)率略有提高，或者煮沸液中含有pcr抑制劑（QPCR的Ct值在11輪左右，感覺可以排除這個(gè)原因）后續(xù)打算用原始文庫擴(kuò)增試一下，看產(chǎn)率是否提高，再次排除抑制劑的影響�；蛘呙恳惠喌膒cr都需要進(jìn)行條件優(yōu)化嗎，關(guān)于退火時(shí)間，溫度，循環(huán)數(shù)。擴(kuò)增循環(huán)數(shù)增加，非特異性條帶增多會(huì)導(dǎo)致目的產(chǎn)物變少嗎？剛接觸到適配體篩選以及PCR這些技術(shù)，還挺懵的，請大家指導(dǎo)一下。 真心期待大家一起討論，感謝大佬相助 |
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今天PCR了
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2樓2021-10-12 15:59:29
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