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構(gòu)建載體 已有3人參與
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請教各位大佬連接有什么好方法嗎？我目的基因雙酶切T4連接pet26b，pcold-tf，pgex-4t三個載體，三個月了都沒有一個連接上的，好痛苦啊！ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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原海亮
木蟲 (著名寫手)
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
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你描述的實驗數(shù)據(jù)還是太有限了，所以很難幫你具體分析是哪里出了問題，你可以了解一下基因克隆的各要素，然后以下思路去試著解決： 1、目的基因方面 你沒有提及你的目的基因來源，是通過pcr獲得的？還是其他載體上切下來的？還是直接基因合成的？ 如果是目的基因PCR獲得的產(chǎn)物，本身PCR產(chǎn)物兩端酶切位點外只有幾個保護(hù)堿基，直接對pcr產(chǎn)物雙酶切會有一些問題，一方面不容易酶切完全，另一方面是否酶切完全比較難以檢測（電泳分辨率達(dá)不到幾bp），所以為了保險起見，可以將pcr產(chǎn)物先連接T載體上，進(jìn)行測序驗證后，在用雙酶切從T載體上面將目的基因切下來，這樣也可以使用電泳檢測來辨別目的基因是否酶切完全（pcr片段只有酶切完全才可以和T載體分離），這樣膠回收得到的目的片段，一般都是雙酶切完全的目的基因。 這里提醒一下，在膠回收得到目的基因后，一定對 獲得的目的基因進(jìn)行電泳檢測，一來避免膠回收失誤導(dǎo)致沒有獲得目的基因，然后也可以確定一下回收的目的基因的濃度。 2、載體的處理 相對于目的基因，載體的處理會影響菌落假陽性的數(shù)量，未酶切完全的載體可能會出現(xiàn)自連，實驗室里面通常對載體處理的經(jīng)驗是，首先看看同樣的載體，同樣的酶切位點，實驗室里有沒有已經(jīng)構(gòu)建好的其他基因的重組載體？我們知道如果從一個pet26空載體（其他載體同理）出發(fā)進(jìn)行雙酶切處理，這個和直接PCR產(chǎn)物酶切是一個道理，是否酶切完全很難檢測確認(rèn)。那么如果以實驗室已有的重組載體（比如pet26-A基因）作為出發(fā)載體雙酶切，相對就容易判斷載體是否酶切完全了（膠回收后電泳檢測）。 如果實驗室沒有這樣的載體，只能通過控制載體酶切條件以及連接反應(yīng)中載體的添加量來提高試驗效率（你也沒有提及沒有連上一個具體是怎么樣的試驗結(jié)果，是沒有一個菌落生長？還是有菌落生長但都是假陽性？這兩個現(xiàn)象是可以幫助你推測可能的原因的）。 3、連接體系 連接體系里主要有雙酶切的片段，雙酶切的載體，連接酶體系，這里默認(rèn)你的商業(yè)連接酶體系是OK 的（你可以自行確認(rèn)），那么控制片段和載體的濃度比是可以適當(dāng)提高連接效率及陽性率的，可以建議你盡可能都得加入你的目的基因，微量的載體，畢竟片段多了在抗性篩選的時候即被淘汰，但載體多了就容易出現(xiàn)自連空載等情況導(dǎo)致假陽性。我們寧可長10個菌都是陽性，也不愿長上千個菌都是假陽性的。 4、轉(zhuǎn)化系統(tǒng) 看你使用的載體應(yīng)該是大腸桿菌的常用載體，大腸桿菌的感受態(tài)及轉(zhuǎn)化方法非常成熟了，默認(rèn)你的這些材料和技術(shù)是沒有問題的，那么下次你進(jìn)行轉(zhuǎn)化的時候，應(yīng)該加入一個陽性對照（比如你實驗室已有的重組載體pet-A）和陰性對照，來確認(rèn)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)OK。 5、陽性克隆篩選 陽性克隆篩選的方法就很多了，但是比較有說服力我推薦是提取質(zhì)粒雙酶切驗證。 6、基因功能方面 應(yīng)該去了解一下你的目的基因或蛋白的可能功能，有一些毒性蛋白可能會影響宿主的生理代謝甚至殺死宿主，導(dǎo)致雖然轉(zhuǎn)化成功，但是菌體無法正常生長的情況。 以上的都是默認(rèn)在你實驗設(shè)計及人為操作沒有問題的情況下分析的，比如你要確定你的酶切位點設(shè)計沒問題，你的抗性選擇沒出現(xiàn)錯誤等等，另外實驗結(jié)果的描述太過于簡單，沒有辦法具體分析，可以適當(dāng)增加每步的實驗結(jié)果現(xiàn)象，有助于問題的解決，祝好！ |
2樓2021-06-21 09:36:06
3樓2021-06-26 18:19:02
gnice
金蟲 (正式寫手)
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4樓2021-12-10 13:00:56
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