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劉加油新蟲 (初入文壇)
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[交流]
構(gòu)建載體 已有3人參與
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請(qǐng)教各位大佬連接有什么好方法嗎？我目的基因雙酶切T4連接pet26b，pcold-tf，pgex-4t三個(gè)載體，三個(gè)月了都沒有一個(gè)連接上的，好痛苦��！ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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原海亮
木蟲 (著名寫手)
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- 專業(yè): 微生物生理與生物化學(xué)
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
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你描述的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)還是太有限了，所以很難幫你具體分析是哪里出了問(wèn)題，你可以了解一下基因克隆的各要素，然后以下思路去試著解決： 1、目的基因方面 你沒有提及你的目的基因來(lái)源，是通過(guò)pcr獲得的？還是其他載體上切下來(lái)的？還是直接基因合成的？ 如果是目的基因PCR獲得的產(chǎn)物，本身PCR產(chǎn)物兩端酶切位點(diǎn)外只有幾個(gè)保護(hù)堿基，直接對(duì)pcr產(chǎn)物雙酶切會(huì)有一些問(wèn)題，一方面不容易酶切完全，另一方面是否酶切完全比較難以檢測(cè)（電泳分辨率達(dá)不到幾bp），所以為了保險(xiǎn)起見，可以將pcr產(chǎn)物先連接T載體上，進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證后，在用雙酶切從T載體上面將目的基因切下來(lái)，這樣也可以使用電泳檢測(cè)來(lái)辨別目的基因是否酶切完全（pcr片段只有酶切完全才可以和T載體分離），這樣膠回收得到的目的片段，一般都是雙酶切完全的目的基因。 這里提醒一下，在膠回收得到目的基因后，一定對(duì) 獲得的目的基因進(jìn)行電泳檢測(cè)，一來(lái)避免膠回收失誤導(dǎo)致沒有獲得目的基因，然后也可以確定一下回收的目的基因的濃度。 2、載體的處理 相對(duì)于目的基因，載體的處理會(huì)影響菌落假陽(yáng)性的數(shù)量，未酶切完全的載體可能會(huì)出現(xiàn)自連，實(shí)驗(yàn)室里面通常對(duì)載體處理的經(jīng)驗(yàn)是，首先看看同樣的載體，同樣的酶切位點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)室里有沒有已經(jīng)構(gòu)建好的其他基因的重組載體？我們知道如果從一個(gè)pet26空載體（其他載體同理）出發(fā)進(jìn)行雙酶切處理，這個(gè)和直接PCR產(chǎn)物酶切是一個(gè)道理，是否酶切完全很難檢測(cè)確認(rèn)。那么如果以實(shí)驗(yàn)室已有的重組載體（比如pet26-A基因）作為出發(fā)載體雙酶切，相對(duì)就容易判斷載體是否酶切完全了（膠回收后電泳檢測(cè)）。 如果實(shí)驗(yàn)室沒有這樣的載體，只能通過(guò)控制載體酶切條件以及連接反應(yīng)中載體的添加量來(lái)提高試驗(yàn)效率（你也沒有提及沒有連上一個(gè)具體是怎么樣的試驗(yàn)結(jié)果，是沒有一個(gè)菌落生長(zhǎng)？還是有菌落生長(zhǎng)但都是假陽(yáng)性？這兩個(gè)現(xiàn)象是可以幫助你推測(cè)可能的原因的）。 3、連接體系 連接體系里主要有雙酶切的片段，雙酶切的載體，連接酶體系，這里默認(rèn)你的商業(yè)連接酶體系是OK 的（你可以自行確認(rèn)），那么控制片段和載體的濃度比是可以適當(dāng)提高連接效率及陽(yáng)性率的，可以建議你盡可能都得加入你的目的基因，微量的載體，畢竟片段多了在抗性篩選的時(shí)候即被淘汰，但載體多了就容易出現(xiàn)自連空載等情況導(dǎo)致假陽(yáng)性。我們寧可長(zhǎng)10個(gè)菌都是陽(yáng)性，也不愿長(zhǎng)上千個(gè)菌都是假陽(yáng)性的。 4、轉(zhuǎn)化系統(tǒng) 看你使用的載體應(yīng)該是大腸桿菌的常用載體，大腸桿菌的感受態(tài)及轉(zhuǎn)化方法非常成熟了，默認(rèn)你的這些材料和技術(shù)是沒有問(wèn)題的，那么下次你進(jìn)行轉(zhuǎn)化的時(shí)候，應(yīng)該加入一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照（比如你實(shí)驗(yàn)室已有的重組載體pet-A）和陰性對(duì)照，來(lái)確認(rèn)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)OK。 5、陽(yáng)性克隆篩選 陽(yáng)性克隆篩選的方法就很多了，但是比較有說(shuō)服力我推薦是提取質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證。 6、基因功能方面 應(yīng)該去了解一下你的目的基因或蛋白的可能功能，有一些毒性蛋白可能會(huì)影響宿主的生理代謝甚至殺死宿主，導(dǎo)致雖然轉(zhuǎn)化成功，但是菌體無(wú)法正常生長(zhǎng)的情況。 以上的都是默認(rèn)在你實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及人為操作沒有問(wèn)題的情況下分析的，比如你要確定你的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)沒問(wèn)題，你的抗性選擇沒出現(xiàn)錯(cuò)誤等等，另外實(shí)驗(yàn)結(jié)果的描述太過(guò)于簡(jiǎn)單，沒有辦法具體分析，可以適當(dāng)增加每步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果現(xiàn)象，有助于問(wèn)題的解決，祝好！ |
2樓2021-06-21 09:36:06
3樓2021-06-26 18:19:02
gnice
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4樓2021-12-10 13:00:56
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