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木查yan新蟲 (初入文壇)
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引物設(shè)計(jì) 已有2人參與
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本人做轉(zhuǎn)化 設(shè)計(jì)好的引物本想擴(kuò)增載體里基因的序列 但是沒轉(zhuǎn)的陰性對照也顯示出條帶 想問下大家 應(yīng)該怎么設(shè)計(jì)引物能避免這種情況發(fā)生呢 謝謝啦 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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mariahit
新蟲 (初入文壇)
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3樓2021-07-09 14:53:47
原海亮
木蟲 (著名寫手)
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- 專業(yè): 微生物生理與生物化學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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由于看不到你pcr的電泳圖，不清楚陰性對照有條帶是什么樣子？大小是多少？和目的條帶一樣么？條帶的濃度和清晰度如何？ 因?yàn)槿绻且再|(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR ，出現(xiàn)非特異性條帶的概率還是比較低的，即相對于基因組做模板，質(zhì)粒模板對引物的質(zhì)量要求不是特別高，一般都可以很好的獲得特異性目的條帶。 出現(xiàn)你這種情況，可以試著分析： 1、對比陰性對照和實(shí)驗(yàn)組，pcr獲得條帶是否一樣？獲得的條帶是目的條帶還是非特異性條帶？有沒有可能沒有獲得目的條帶，而是引物二聚體？（可增加不加引物的陰性對照）。 2、確定模板正常，陰性對照使用的水是否有污染？實(shí)驗(yàn)組使用的質(zhì)粒濃度如何？配制體系時(shí)候是否有交叉污染的可能？ 3、引物設(shè)計(jì)是以質(zhì)粒載體為模板設(shè)計(jì)的？還是以基因組模板設(shè)計(jì)，然后用質(zhì)粒擴(kuò)增？按道理質(zhì)粒大小一般在10K以下，這么小的模板出現(xiàn)非特異性的概率還是比較低的，除非你的引物質(zhì)量太差，或者加入酶切位點(diǎn)后導(dǎo)致引物質(zhì)量下降？ 最好可以放一張電泳圖供參考，祝好！ |
2樓2021-06-18 08:44:06
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