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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » PCR相關 » 引物設計
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[求助]
引物設計 已有2人參與
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本人做轉化 設計好的引物本想擴增載體里基因的序列 但是沒轉的陰性對照也顯示出條帶 想問下大家 應該怎么設計引物能避免這種情況發(fā)生呢 謝謝啦 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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原海亮
木蟲 (著名寫手)
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- 專業(yè): 微生物生理與生物化學
【答案】應助回帖
感謝參與，應助指數(shù) +1
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由于看不到你pcr的電泳圖，不清楚陰性對照有條帶是什么樣子？大小是多少？和目的條帶一樣么？條帶的濃度和清晰度如何？ 因為如果是以質粒為模板進行PCR ，出現(xiàn)非特異性條帶的概率還是比較低的，即相對于基因組做模板，質粒模板對引物的質量要求不是特別高，一般都可以很好的獲得特異性目的條帶。 出現(xiàn)你這種情況，可以試著分析： 1、對比陰性對照和實驗組，pcr獲得條帶是否一樣？獲得的條帶是目的條帶還是非特異性條帶？有沒有可能沒有獲得目的條帶，而是引物二聚體？（可增加不加引物的陰性對照）。 2、確定模板正常，陰性對照使用的水是否有污染？實驗組使用的質粒濃度如何？配制體系時候是否有交叉污染的可能？ 3、引物設計是以質粒載體為模板設計的？還是以基因組模板設計，然后用質粒擴增？按道理質粒大小一般在10K以下，這么小的模板出現(xiàn)非特異性的概率還是比較低的，除非你的引物質量太差，或者加入酶切位點后導致引物質量下降？ 最好可以放一張電泳圖供參考，祝好！ |
2樓2021-06-18 08:44:06
mariahit
新蟲 (初入文壇)
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- 專業(yè): 生物物理、生物化學與分子
3樓2021-07-09 14:53:47
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