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| 【懸賞金幣】回答本帖問題，作者mrzzy將贈(zèng)送您 5 個(gè)金幣 | |||
mrzzy新蟲 (初入文壇)
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[求助]
T載體連接與連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞 已有2人參與
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轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞長(zhǎng)不出來，希望大家?guī)兔Ψ治鲆幌驴赡苁悄睦锍隽藛栴}。 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析回來的結(jié)果是，一個(gè)基因長(zhǎng)度為697bp，另一個(gè)基因長(zhǎng)度為660bp。最后擴(kuò)增出來的條帶均在1kbp附近，且無其他明亮條帶。回收濃度分別為37和39 。T載體使用艾德萊的“零背景pTOPO—Blunt Simple平末端克隆試劑盒”，試劑盒剛剛到是新的。感受態(tài)細(xì)胞使用購買的維地DH5α。做了三次了，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至18h，延長(zhǎng)連接時(shí)間（說明書是5min），嚴(yán)格把控?zé)峒r(shí)間，但是最后板子上連個(gè)雜菌都沒有。。。希望哪位大神幫忙分析一下可能是什么問題 |
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原海亮
木蟲 (著名寫手)
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- 專業(yè): 微生物生理與生物化學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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根據(jù)你的描述，可以從以下思路考慮： 1、PCR體系方面，關(guān)于你說的“轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析回來的結(jié)果是，一個(gè)基因長(zhǎng)度為697bp，另一個(gè)基因長(zhǎng)度為660bp。最后擴(kuò)增出來的條帶均在1kbp附近，且無其他明亮條帶”，沒有看太懂什么意識(shí)，姑且認(rèn)為你是想表達(dá)目的條帶沒有問題吧。 使用的是平末端T克隆試劑盒，樓主應(yīng)確認(rèn)一下你PCR使用的酶是否合適？是不是也應(yīng)該用PCR產(chǎn)物為平末端的聚合酶？粘性末端的酶是不是應(yīng)該處理成平末端或是否需要磷酸化？（試劑盒里面應(yīng)該有介紹）。 2、連接或轉(zhuǎn)化體系方面，平末端的T載體應(yīng)該比較難自連的，基本上平板要不不長(zhǎng)菌，要不就是陽性克隆，假陽性概率比較低（載體自連造成）。所以你一直沒有菌生長(zhǎng)，可能是片段處理或者轉(zhuǎn)化的問題，試劑盒里面一般有陽性對(duì)照樣品，你可以下次實(shí)驗(yàn)時(shí)候做一個(gè)陽性對(duì)照和一個(gè)陰性對(duì)照，驗(yàn)證一下是不是試劑盒或者轉(zhuǎn)化條件的問題（也可以和試劑盒公司的技術(shù)支持人員溝通交流一下使用技巧）。 3、確認(rèn)一下平板抗性是否正確或者抗生素是否有問題。 4、T載克隆是比較常常用的一個(gè)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，因其簡(jiǎn)單易操作（PCR產(chǎn)物可以不用酶切直接連T載體），一般會(huì)用于做亞克隆前的PCR片段測(cè)序，片段的酶切處理或者酶切位點(diǎn)的替換（PCR產(chǎn)物直接雙酶切不易驗(yàn)證是否酶切完全，連了T載體后再酶切易確認(rèn)片段是否被酶切完全）等。 但是T載體克隆并不是基因克隆過程中必須的實(shí)驗(yàn)步驟，現(xiàn)在很多的分子生物學(xué)研究人員基本上不用T載體克隆，直接進(jìn)行片段處理后與目標(biāo)載體連接，測(cè)序等。 所以如果工作在此停滯太久，耽誤實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，把簡(jiǎn)單的事情搞的復(fù)雜化了，也就體現(xiàn)不出來T克隆的優(yōu)勢(shì)作用，那么完全可以考慮更換一個(gè)T克隆試劑盒，甚至可以直接跳過T克隆，直接進(jìn)行目的載體的克隆連接。 祝好！ |
2樓2021-06-07 11:23:14
3樓2021-06-09 17:29:36
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