 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 3 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 2299 | 回復(fù): 2 | ||
| 【懸賞金幣】回答本帖問題，作者mrzzy將贈(zèng)送您 5 個(gè)金幣 | ||
mrzzy新蟲 (初入文壇)
|
[求助]
T載體連接與連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞 已有2人參與
|
|
|
轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞長(zhǎng)不出來，希望大家?guī)兔Ψ治鲆幌驴赡苁悄睦锍隽藛栴}。 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析回來的結(jié)果是，一個(gè)基因長(zhǎng)度為697bp，另一個(gè)基因長(zhǎng)度為660bp。最后擴(kuò)增出來的條帶均在1kbp附近，且無其他明亮條帶。回收濃度分別為37和39 。T載體使用艾德萊的“零背景pTOPO—Blunt Simple平末端克隆試劑盒”，試劑盒剛剛到是新的。感受態(tài)細(xì)胞使用購(gòu)買的維地DH5α。做了三次了，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至18h，延長(zhǎng)連接時(shí)間（說明書是5min），嚴(yán)格把控?zé)峒r(shí)間，但是最后板子上連個(gè)雜菌都沒有。。。希望哪位大神幫忙分析一下可能是什么問題 |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：實(shí)驗(yàn)器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：和實(shí)驗(yàn)材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤(rùn)色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有58人回復(fù)
-
蛋白質(zhì)檢測(cè)：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之小鼠實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)，解析生命機(jī)制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測(cè)：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測(cè)重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
原海亮
木蟲 (著名寫手)
- 應(yīng)助: 232 (大學(xué)生)
- 金幣: 4607.4
- 散金: 3521
- 紅花: 33
- 帖子: 1804
- 在線: 375.4小時(shí)
- 蟲號(hào): 1392705
- 注冊(cè): 2011-09-06
- 性別: GG
- 專業(yè): 微生物生理與生物化學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
|
根據(jù)你的描述，可以從以下思路考慮： 1、PCR體系方面，關(guān)于你說的“轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析回來的結(jié)果是，一個(gè)基因長(zhǎng)度為697bp，另一個(gè)基因長(zhǎng)度為660bp。最后擴(kuò)增出來的條帶均在1kbp附近，且無其他明亮條帶”，沒有看太懂什么意識(shí)，姑且認(rèn)為你是想表達(dá)目的條帶沒有問題吧。 使用的是平末端T克隆試劑盒，樓主應(yīng)確認(rèn)一下你PCR使用的酶是否合適？是不是也應(yīng)該用PCR產(chǎn)物為平末端的聚合酶？粘性末端的酶是不是應(yīng)該處理成平末端或是否需要磷酸化？（試劑盒里面應(yīng)該有介紹）。 2、連接或轉(zhuǎn)化體系方面，平末端的T載體應(yīng)該比較難自連的，基本上平板要不不長(zhǎng)菌，要不就是陽(yáng)性克隆，假陽(yáng)性概率比較低（載體自連造成）。所以你一直沒有菌生長(zhǎng)，可能是片段處理或者轉(zhuǎn)化的問題，試劑盒里面一般有陽(yáng)性對(duì)照樣品，你可以下次實(shí)驗(yàn)時(shí)候做一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照和一個(gè)陰性對(duì)照，驗(yàn)證一下是不是試劑盒或者轉(zhuǎn)化條件的問題（也可以和試劑盒公司的技術(shù)支持人員溝通交流一下使用技巧）。 3、確認(rèn)一下平板抗性是否正確或者抗生素是否有問題。 4、T載克隆是比較常常用的一個(gè)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，因其簡(jiǎn)單易操作（PCR產(chǎn)物可以不用酶切直接連T載體），一般會(huì)用于做亞克隆前的PCR片段測(cè)序，片段的酶切處理或者酶切位點(diǎn)的替換（PCR產(chǎn)物直接雙酶切不易驗(yàn)證是否酶切完全，連了T載體后再酶切易確認(rèn)片段是否被酶切完全）等。 但是T載體克隆并不是基因克隆過程中必須的實(shí)驗(yàn)步驟，現(xiàn)在很多的分子生物學(xué)研究人員基本上不用T載體克隆，直接進(jìn)行片段處理后與目標(biāo)載體連接，測(cè)序等。 所以如果工作在此停滯太久，耽誤實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，把簡(jiǎn)單的事情搞的復(fù)雜化了，也就體現(xiàn)不出來T克隆的優(yōu)勢(shì)作用，那么完全可以考慮更換一個(gè)T克隆試劑盒，甚至可以直接跳過T克隆，直接進(jìn)行目的載體的克隆連接。 祝好！ |
2樓2021-06-07 11:23:14
3樓2021-06-09 17:29:36
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 mrzzy 的主題更新
| 3 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 304求調(diào)劑 +4 | 曼殊2266 2026-03-05 | 4/200 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 紡織、生物、化學(xué)、材料等專業(yè) +3 | Eember. 2026-03-05 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 283求調(diào)劑 +10 | 鹿沫笙 2026-03-02 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 一志愿天津大學(xué)085600 319分 材料與化工 金屬方向 求調(diào)劑 +6 | 青科11 2026-03-02 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 266求調(diào)劑 +7 | 哇塞王帥 2026-03-03 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 成績(jī)276，專業(yè)代碼0856求調(diào)劑 +10 | 小陳朵 2026-03-03 | 10/500 |
|
|
|
[考研]
085600 英一數(shù)二272求調(diào)劑
 5+6
|
vida_a 2026-03-01 | 47/2350 |
|
|
|
[考研] 環(huán)境調(diào)劑 +8 | chenhanheng 2026-03-02 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 298求調(diào)劑 +3 | 人間唯你是清歡 2026-03-03 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 化工專碩348，一志愿985求調(diào)劑 +8 | 弗格個(gè) 2026-02-28 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 材料學(xué)碩318求調(diào)劑 +11 | February_Feb 2026-03-01 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 268求調(diào)劑 +6 | 好運(yùn)連綿不絕 2026-03-02 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 材料工程求調(diào)劑 +3 | 1431251 2026-03-03 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 化工京區(qū)271求調(diào)劑 +7 | 11ing 2026-03-02 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 298求調(diào)劑 +7 | axyz3 2026-02-28 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 288求調(diào)劑 +3 | 少71.8 2026-03-02 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 材料與化工328求調(diào)劑 +3 | 。，。，。，。i 2026-03-02 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 哈工大計(jì)算機(jī)劉劼團(tuán)隊(duì)招生 +4 | hit_aiot 2026-03-01 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 264求調(diào)劑 +4 | 巴拉巴拉根556 2026-02-28 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 311求調(diào)劑 +6 | 亭亭亭01 2026-03-01 | 6/300 |
|