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LS-Cui新蟲(chóng) (初入文壇)
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[交流]
做快速核酸檢測(cè)需要知道的那些技術(shù)（一）
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等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的基于恒溫?cái)U(kuò)增的新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，其中就包括重組酶和聚合酶等溫檢測(cè)技術(shù)，基于多年的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，今天就來(lái)談?wù)勂湓�、特點(diǎn)、應(yīng)用以及相關(guān)信息： 1、重組酶和聚合酶等溫檢測(cè)是什么？ 重組酶和聚合酶等溫檢測(cè)是一種等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，可在等溫條件下(一般為37℃-40℃)，5-20min內(nèi)，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)目的核酸片段的擴(kuò)增，是采用重組酶代替PCR的高溫變性，完成對(duì)雙鏈的解鏈，解開(kāi)的雙鏈被單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合，防止DNA鏈復(fù)性，再由聚合酶完成鏈的延伸，實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增。 模擬T4噬菌體在體內(nèi)的核酸擴(kuò)增。 2、重組酶和聚合酶等溫檢測(cè)基本原理是什么？ 重組酶和聚合酶等溫檢測(cè)主要使用了三種酶：重組酶、單鏈結(jié)合蛋白和DNA聚合酶，整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程大體可分為三個(gè)過(guò)程：一，重組酶和引物形成重組酶/引物復(fù)合體，在DNA雙鏈上找到和引物配對(duì)區(qū)域，然后入侵，解開(kāi)雙鏈為單鏈DNA，并且引物配對(duì)；二，解開(kāi)的單鏈DNA與單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合，防止單鏈DNA再度復(fù)性為雙鏈DNA；三，在DNA聚合酶的作用下，催化鏈的延伸，生成新的DNA鏈。經(jīng)過(guò)幾十個(gè)循環(huán)后，DNA新鏈的數(shù)量指數(shù)增長(zhǎng)。 3、重組酶和聚合酶等溫檢測(cè)技術(shù)特點(diǎn)是什么？ (1) 等溫?cái)U(kuò)增，使現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)成為可能 重組酶和聚合酶等溫檢測(cè)的反應(yīng)溫度為37℃，擺脫儀器的束縛，使得儀器簡(jiǎn)單化和小型化，可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。 (2) 快速擴(kuò)增，極大縮短反應(yīng)時(shí)間 5-20min內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)對(duì)目的核酸片段的擴(kuò)增，非常符合快速檢測(cè)的需求。 (3) 靈敏度高，特異性強(qiáng) 具有同PCR同等的靈敏度，重組酶和聚合酶等溫檢測(cè)要求引物長(zhǎng)度不低于30bp，進(jìn)一步使擴(kuò)增的特異性增強(qiáng)。 (4) 引物探針設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單 引物和探針設(shè)計(jì)原則同PCR的設(shè)計(jì)原則相似，略微不同的是重組酶和聚合酶等溫檢測(cè)的引物長(zhǎng)度要不低于30bp，探針長(zhǎng)度不低于45bp。 (5) 實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè) 通過(guò)熒光探針的加入，可在整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中對(duì)結(jié)果進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，方便結(jié)果的判讀。 (6) 操作簡(jiǎn)單 重組酶和聚合酶等溫檢測(cè)的操作過(guò)程非常簡(jiǎn)單，只需要將相關(guān)溶液簡(jiǎn)單加入到試劑中即可，而且整個(gè)加入過(guò)程都可以在室溫下進(jìn)行，這就使得使用人員經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單培訓(xùn)，就可以進(jìn)行操作更適合廣泛推廣。 4、重組酶和聚合酶等溫檢測(cè)的應(yīng)用 可用于病原體的檢測(cè)和突變基因的檢測(cè)，包括不限制于體外診斷，動(dòng)植物疫病檢測(cè)、寵物病原體檢測(cè)、腸道微生物檢測(cè)、食源性微生物檢測(cè)等。 5、重組酶和聚合酶等溫檢測(cè)是否可對(duì)RNA進(jìn)行擴(kuò)增？ 可以，在重組酶和聚合酶等溫檢測(cè)反應(yīng)體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)RNA的一步法擴(kuò)增。 |
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