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LS-Cui新蟲 (初入文壇)
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RPA檢測技術(shù)干貨分享——你想知道的那些事（三）
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今天繼續(xù)分享關(guān)于核酸擴增檢測中一些試劑污染的注意事項，這次來談?wù)勛畛Ｒ姷奈廴締栴}——氣溶膠污染。 1.什么是氣溶膠 氣溶膠是指懸浮在氣體介質(zhì)中的固態(tài)或液態(tài)顆粒所組成的氣態(tài)分散系統(tǒng)。這些固態(tài)或液態(tài)顆粒的密度與氣體介質(zhì)的密度可以相差微小，也可以懸殊很大。通過核酸擴增的方式進(jìn)行核酸檢測時，在操作過程中容易受到污染，導(dǎo)致假陽性的結(jié)果。其中最常見，且最難消除的污染就是氣溶膠污染。 2.氣溶膠是如何產(chǎn)生的 在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠。在操作時比較劇烈地?fù)u動反應(yīng)管，開蓋時、吸樣時及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染。據(jù)計算，一個氣溶膠顆粒可含48000拷貝，因此由其造成的污染是一個值得特別重視的問題。 3.哪些環(huán)節(jié)容易產(chǎn)生氣溶膠 （1） 核酸提取環(huán)節(jié) 這時候，你所用的移液器是直接吸取核酸溶液的，一些氣溶膠理論上會進(jìn)入到移液器里，假如你再用這些移液器進(jìn)行核酸擴增操作，就有產(chǎn)生氣溶膠污染的可能。 （2）核酸擴增結(jié)束，進(jìn)行擴增產(chǎn)物電泳時 這時候，樣品核酸經(jīng)過核酸擴增反應(yīng)，產(chǎn)物的濃度百萬倍增加，移液器吸取擴增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，這時候加樣的移液器百分百會被氣溶膠污染，假如你用電泳點樣的移液器再去進(jìn)行核酸擴增操作，基本上百分百會污染。 氣溶膠的污染主要發(fā)生在擴增產(chǎn)物分析階段，因為擴增產(chǎn)物拷貝量大（一般為10的13次方拷貝/ml），所以極微量的PCR產(chǎn)物就會造成假陽性。另外，因為在空氣與液體面摩擦?xí)r會形成氣溶膠，所以比較劇烈地?fù)u動反應(yīng)管,開蓋時吸樣，以及反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠污染。 核酸氣溶膠污染產(chǎn)生不是瞬間的事情，而是一個累積的過程。如果我們在日常實驗中，就有目地性的規(guī)避，規(guī)范操作，做好清潔消菌，能很大程度上避免核酸氣溶膠污染。 4.當(dāng)污染真的出現(xiàn)時，該如何有效處理 （1）紫外線處理 由于DNA鏈上相鄰的嘧啶在254 mn紫外誘導(dǎo)下發(fā)生交聯(lián)，嘧啶二聚體不能被切除，導(dǎo)致DNA聚合酶在空間上被阻礙或者DNA不能被完全變性，從而使合成反應(yīng)終止。實驗結(jié)束后，打開實驗室各區(qū)域的紫外燈進(jìn)行紫外消毒，照射時間≥1h，由于小的擴增子只有較少的臨近嘧啶，所以該方法對小的擴增子效果不明顯。 （2）次氯酸鈉 次氯酸鈉具有氧化損傷核酸的作用，從而使留在實驗室的擴增產(chǎn)物被破壞掉。一般使用10%的次氯酸鈉溶液。操作時，先用75%酒精對實驗室空氣進(jìn)行密集噴淋，目的是對實驗過程中生成的氣溶膠產(chǎn)生較好的沉降效果。噴淋結(jié)束立即采用次氯酸鈉擦拭工作臺面/拖擦地面，作用10 min后用清水擦拭工作臺面，并保持通風(fēng)。 （3）通風(fēng) 如果已經(jīng)發(fā)生污染，一定要做好通風(fēng)，先用酒精或者其他消毒劑在每個角落噴灑，一定做到無死角，然后再用市面上的核酸氣溶膠污染清潔劑去噴灑，一樣做到無死角，再通風(fēng)，擦拭，過段時間，再污染監(jiān)控應(yīng)該就差不多了。 核酸檢測實驗室污染的防治措施包括但不限于以上幾種，為了避免由于污染造成的假陽性等現(xiàn)象，保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，檢測人員應(yīng)嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，把“防污染”貫穿于整個實驗過程中。 |
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