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hellohuo金蟲 (小有名氣)
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[求助]
植物基因敲低表達，用CRISPR還是用RNAi？ 已有2人參與
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| 最近想要做植物內(nèi)某個基因的沉默，一直糾結(jié)于用Crispr，還是用傳統(tǒng)的RNAi技術(shù)，我的目的想要看該基因敲低后的相關(guān)生理狀態(tài)，并不一定非要敲除，擔(dān)心徹底敲除某個基因會引起其他生理反應(yīng)，而不是我預(yù)期的生理現(xiàn)象。因此，想求教各位大神，這兩個技術(shù)手段的優(yōu)缺點，針對我的實驗?zāi)康�，有沒有大神可以給點建議？謝謝！ |
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【答案】應(yīng)助回帖
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hellohuo: 金幣+15, ★★★很有幫助, 感謝您的回答，明白了很多！ 2021-02-20 09:36:55
hellohuo: 金幣+15, ★★★很有幫助, 感謝您的回答，明白了很多！ 2021-02-20 09:36:55
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1：研究對象是擬南芥？是單子葉植物還是雙子葉植物？載體不同侵染物種不同，但無論是什么植物基本上CRISPR都需要構(gòu)建雙元載體，U6啟動子的中間載體，及連接Cas9的表達載體（pYAO-AtU6-Cas9侵染擬南芥，而pCA1300-OsU6-Cas9適合水稻） 2：理論上講Cas9會切割基因組DNA雙鏈，再設(shè)計sgRNA靶點NGG，的N位點，DNA利用修復(fù)產(chǎn)生錯配，造成替換，串碼，提前終止，再侵染完成后的T1代就能拿到純合株系！注意，此時的純合株系里含有Cas9融合蛋白，需于野生型雜交將Cas9分離篩掉 3: 若是你的基因功能在植物生長發(fā)育階段起到了重要功能，若是缺失了，肯定會有表型的（包括雜合） |
9樓2020-12-12 13:47:51
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
hellohuo: 金幣+5, ★★★很有幫助, 感謝您的回答，明白了很多！ 2021-02-20 09:38:45
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
hellohuo: 金幣+5, ★★★很有幫助, 感謝您的回答，明白了很多！ 2021-02-20 09:38:45
| 基于你的描述和研究目的，建議還是做RNAi吧。通常來說，RNAi是降低基因的表達量，即knock-down，但不會完全使基因功能喪失（多數(shù)情況下），而CRISPR介導(dǎo)的基因敲除（knock-out），顧名思義，通過在基因編碼區(qū)引入堿基缺失或插入，造成移碼突變或提前終止翻譯等，可以實現(xiàn)將基因功能完成喪失。 |
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2樓2020-11-28 13:31:27
hellohuo
金蟲 (小有名氣)
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- 性別: MM
- 專業(yè): 植物生理與生化
送紅花一朵 |
還想請教一下，基于目前所有關(guān)于敲低與敲除的實驗，感覺用CRISPR的比較多，而RNAi逐漸變少了，是因為RNAi的技術(shù)存在某種問題？還是說大家都朝著新技術(shù)CRISPR發(fā)展？我覺得徹底敲除可能會造成生理功能的其他連鎖變化。因為有些基因?qū)τ诎l(fā)育還是挺重要的，直接敲除，可能除了它本身的功能，也連帶會出現(xiàn)別的生理變化，這種并不能說明連帶的功能就是這個基因本身的功能。我覺得別人肯定也有考慮到這個問題，但是為什么大家還選擇CRISPR呢？因為我對這個技術(shù)不是很了解，所以有哪些原因是我沒想到的，求指教！謝謝�。�！ |
3樓2020-12-02 09:14:29
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大家還選擇CRISPR進行基因功能研究，，最主要的還是該技術(shù)可以實現(xiàn)基因敲除，更確定地是突變體材料的定制，理論上可以實現(xiàn)任意位點的核苷酸序列的改變（編輯），比如特定的編碼區(qū)、結(jié)構(gòu)域、順勢作用元件、內(nèi)含子等。其次，CRISPR技術(shù)獲得材料最后是可以不含外源T-DNA的，意味著在生產(chǎn)上應(yīng)用的潛力加大，同時更重要的是可以在此基礎(chǔ)上再次進行其他基因的敲除，實現(xiàn)多基因敲除（當合理設(shè)計攜帶多個sgRNA也能輕易地進行多基因敲除）。由于CRIPSR的高特異性，對于相似度極高的同源基因也能很好地實現(xiàn)靶基因的敲除。 選擇CRISPR還是RNAi，關(guān)鍵取決于各自的試驗內(nèi)容及目的吧，畢竟這倆只是單純的技術(shù)而已，各有有缺，合理使用即可。 你之前有相關(guān)的實驗數(shù)據(jù)表明該基因敲除對發(fā)育有嚴重影響嗎？ |
4樓2020-12-02 12:01:36
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