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三種快速支原體檢測試劑盒檢測原理與優(yōu)缺點比較
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在細(xì)胞培養(yǎng)，特別是傳代細(xì)胞培養(yǎng)中，支原體污染率達(dá)到15-35%。支原體的侵染會引起細(xì)胞功能和基因表達(dá)的嚴(yán)重改變，并造成持續(xù)危害。由于支原體污染會嚴(yán)重影響實驗結(jié)果的可靠性、重復(fù)性和一致性，對支原體的常規(guī)檢測非常重要。 傳統(tǒng)的支原體檢測方法很耗費時間，通常需要一天至數(shù)周，而且操作比較繁瑣，準(zhǔn)確度不高。 中國藥典給定的支原體標(biāo)準(zhǔn)檢測方法有兩種：培養(yǎng)法和DNA染色法。培養(yǎng)法方法簡單，假陽性率低，但樣品需要量高，耗時20天左右，時間漫長。DNA染色法結(jié)果直觀，假陽性率低，但需要熒光顯微設(shè)備，實驗操作復(fù)雜。 能否找到一種省時、省力且準(zhǔn)確性高的方法檢測支原體污染呢？ 目前，市場上具有多款支原體快速檢測試劑盒，我們選取了其中3種品牌的快速支原體檢測試劑盒，就其檢測原理與優(yōu)缺點進行一下比較。 一、美國CLARK Bioscience品牌一步法檢測試劑盒 美國CLARK Bioscience公司研發(fā)的一步法支原體檢測試劑盒One-step Quickcolor Mycoplasma Detection Kit，利用等溫擴增的方法，可檢測7種常見支原體的基因。 該檢測方法與PCR方法類似，檢測過程中，只需取少量細(xì)胞培養(yǎng)上清，及一個能控制溫度的水浴鍋或恒溫金屬浴，其擴增產(chǎn)物的顏色可通過肉眼直接觀察判斷，整個過程需要1小時左右。 該方法對儀器的要求比較低，理論上靈敏度比較高。缺點在于檢測的支原體種類太少，目前已發(fā)現(xiàn)的近200種支原體，只能檢測其中的7種，檢測范圍太窄，也不符合國家藥典的規(guī)定。而且肉眼觀察結(jié)果比較主觀，有可能不同的實驗人員判讀的結(jié)果不一致。 二、美國Lonza品牌生物發(fā)光法檢測試劑盒 美國Lonza品牌的MycoAlertTM 和升級的MycoAlertTM PLUS支原體檢測試劑盒，采用生物發(fā)光的方法，檢測支原體酶活性。其檢測的支原體酶廣泛存在于180多種支原體中，而不存在于真核細(xì)胞中。 該方法利用支原體酶的特定活性，進行選擇性的生物化學(xué)檢測。當(dāng)支原體被溶解后，釋放的酶與支原體檢測試劑盒中提供的底物發(fā)生催化反應(yīng)，將ADP轉(zhuǎn)化成ATP，參與生物發(fā)光反應(yīng)，并可通過分光光度計測定。如果樣品添加底物后讀數(shù)上升，表明存在支原體污染。整個實驗過程需要20分鐘左右。 該方法能夠檢測的支原體種類比較全，檢測結(jié)果量化，容易判斷，耗時短。缺點是需要配置發(fā)光儀或多功能酶標(biāo)儀，知名度不如擴增法，靈敏度也可能低于擴增法。 三、蘇州先達(dá)基因支原體檢測試劑盒 我國蘇州先達(dá)基因研發(fā)了一種細(xì)胞污染支原體檢測試劑盒，從樣本處理到讀取檢測結(jié)果只需30分鐘左右。檢測范圍涵蓋130種支原體。 其原理是基于該公司自主開發(fā)的實時熒光恒溫核酸檢測技術(shù)（ERA），該技術(shù)可以在恒定的低溫下（25℃-42℃）對痕量的支原體種內(nèi)保守性DNA片段進行特異性的擴增，樣本的處理只需吸取200微升的細(xì)胞懸95℃水浴2分鐘作為模板，反應(yīng)體系需置于熒光定量檢測儀中進行，設(shè)置溫度為37℃，擴增反應(yīng)可以在20分鐘內(nèi)完成，觀察熒光定量檢測儀顯示的擴增曲線判讀檢測結(jié)果。 該方法利用了一種恒溫核酸擴增方法，靈敏度比PCR高10-100倍，可以在恒定的低溫條件下進行，而且用時在30分鐘以內(nèi)，并且檢測范圍涵蓋130種支原體，是一種比較理想的支原體檢測方法。缺點是該試劑盒需要借助熒光定量檢測儀，儀器往往比較昂貴，不過先達(dá)基因推出了專用的熒光定量檢測儀，該方法對溫度控制元件要求不高，所以該儀器相對比較便宜而且小巧。 |
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