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小小書(shū)蟲(chóng)飛新蟲(chóng) (小有名氣)
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三種快速支原體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)原理與優(yōu)缺點(diǎn)比較
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在細(xì)胞培養(yǎng)，特別是傳代細(xì)胞培養(yǎng)中，支原體污染率達(dá)到15-35%。支原體的侵染會(huì)引起細(xì)胞功能和基因表達(dá)的嚴(yán)重改變，并造成持續(xù)危害。由于支原體污染會(huì)嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性、重復(fù)性和一致性，對(duì)支原體的常規(guī)檢測(cè)非常重要。 傳統(tǒng)的支原體檢測(cè)方法很耗費(fèi)時(shí)間，通常需要一天至數(shù)周，而且操作比較繁瑣，準(zhǔn)確度不高。 中國(guó)藥典給定的支原體標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法有兩種：培養(yǎng)法和DNA染色法。培養(yǎng)法方法簡(jiǎn)單，假陽(yáng)性率低，但樣品需要量高，耗時(shí)20天左右，時(shí)間漫長(zhǎng)。DNA染色法結(jié)果直觀，假陽(yáng)性率低，但需要熒光顯微設(shè)備，實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜。 能否找到一種省時(shí)、省力且準(zhǔn)確性高的方法檢測(cè)支原體污染呢？ 目前，市場(chǎng)上具有多款支原體快速檢測(cè)試劑盒，我們選取了其中3種品牌的快速支原體檢測(cè)試劑盒，就其檢測(cè)原理與優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行一下比較。 一、美國(guó)CLARK Bioscience品牌一步法檢測(cè)試劑盒 美國(guó)CLARK Bioscience公司研發(fā)的一步法支原體檢測(cè)試劑盒One-step Quickcolor Mycoplasma Detection Kit，利用等溫?cái)U(kuò)增的方法，可檢測(cè)7種常見(jiàn)支原體的基因。 該檢測(cè)方法與PCR方法類(lèi)似，檢測(cè)過(guò)程中，只需取少量細(xì)胞培養(yǎng)上清，及一個(gè)能控制溫度的水浴鍋或恒溫金屬浴，其擴(kuò)增產(chǎn)物的顏色可通過(guò)肉眼直接觀察判斷，整個(gè)過(guò)程需要1小時(shí)左右。 該方法對(duì)儀器的要求比較低，理論上靈敏度比較高。缺點(diǎn)在于檢測(cè)的支原體種類(lèi)太少，目前已發(fā)現(xiàn)的近200種支原體，只能檢測(cè)其中的7種，檢測(cè)范圍太窄，也不符合國(guó)家藥典的規(guī)定。而且肉眼觀察結(jié)果比較主觀，有可能不同的實(shí)驗(yàn)人員判讀的結(jié)果不一致。 二、美國(guó)Lonza品牌生物發(fā)光法檢測(cè)試劑盒 美國(guó)Lonza品牌的MycoAlertTM 和升級(jí)的MycoAlertTM PLUS支原體檢測(cè)試劑盒，采用生物發(fā)光的方法，檢測(cè)支原體酶活性。其檢測(cè)的支原體酶廣泛存在于180多種支原體中，而不存在于真核細(xì)胞中。 該方法利用支原體酶的特定活性，進(jìn)行選擇性的生物化學(xué)檢測(cè)。當(dāng)支原體被溶解后，釋放的酶與支原體檢測(cè)試劑盒中提供的底物發(fā)生催化反應(yīng)，將ADP轉(zhuǎn)化成ATP，參與生物發(fā)光反應(yīng)，并可通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定。如果樣品添加底物后讀數(shù)上升，表明存在支原體污染。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程需要20分鐘左右。 該方法能夠檢測(cè)的支原體種類(lèi)比較全，檢測(cè)結(jié)果量化，容易判斷，耗時(shí)短。缺點(diǎn)是需要配置發(fā)光儀或多功能酶標(biāo)儀，知名度不如擴(kuò)增法，靈敏度也可能低于擴(kuò)增法。 三、蘇州先達(dá)基因支原體檢測(cè)試劑盒 我國(guó)蘇州先達(dá)基因研發(fā)了一種細(xì)胞污染支原體檢測(cè)試劑盒，從樣本處理到讀取檢測(cè)結(jié)果只需30分鐘左右。檢測(cè)范圍涵蓋130種支原體。 其原理是基于該公司自主開(kāi)發(fā)的實(shí)時(shí)熒光恒溫核酸檢測(cè)技術(shù)（ERA），該技術(shù)可以在恒定的低溫下（25℃-42℃）對(duì)痕量的支原體種內(nèi)保守性DNA片段進(jìn)行特異性的擴(kuò)增，樣本的處理只需吸取200微升的細(xì)胞懸95℃水浴2分鐘作為模板，反應(yīng)體系需置于熒光定量檢測(cè)儀中進(jìn)行，設(shè)置溫度為37℃，擴(kuò)增反應(yīng)可以在20分鐘內(nèi)完成，觀察熒光定量檢測(cè)儀顯示的擴(kuò)增曲線(xiàn)判讀檢測(cè)結(jié)果。 該方法利用了一種恒溫核酸擴(kuò)增方法，靈敏度比PCR高10-100倍，可以在恒定的低溫條件下進(jìn)行，而且用時(shí)在30分鐘以?xún)?nèi)，并且檢測(cè)范圍涵蓋130種支原體，是一種比較理想的支原體檢測(cè)方法。缺點(diǎn)是該試劑盒需要借助熒光定量檢測(cè)儀，儀器往往比較昂貴，不過(guò)先達(dá)基因推出了專(zhuān)用的熒光定量檢測(cè)儀，該方法對(duì)溫度控制元件要求不高，所以該儀器相對(duì)比較便宜而且小巧。 |
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