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[交流]
PCR擴增不出條帶，救救孩子吧
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菌株：一株放線菌 基因組GC含量較高，68.5%。 前期想通過重疊延伸PCR把上下游同源臂連起來，但一直沒有目的條帶，后面重新設計了一次引物，但只能擴增出引物二聚體，這期間用了TaKaRa的 LA taq with GC buffer、EmeraldAmp® PCR Master Mix以及全式金的TransStart® FastPfu DNA Polymerase 結果都是要么沒有條帶要么都是引物二聚體，體系都是25ul，也嘗試過加入DMSO 也不行，但這個菌的16S用上述酶都能擴增出來。 后來考慮到重疊延伸PCR引物的酶切修飾 重疊部分 可能對二聚體、擴增有影響，就隨便從基因組上挑選了一個片段用oligo設計了一個評分都很好的引物（見圖），也blast過特異性，引物合成單上Tm值都是63度左右，就想驗證一下我這個菌到底能不能擴增片段  圖片1中 左邊第一道是提取基因組 DL5000 MARKER（從下往上是100、200 500、750bp）左邊是FastPfu 體系25ul（引物 0.2uM 模板 150ng 酶0.5ul 1*PCR stimulant 用于擴增富含GC/復雜模板）。程序：98度3min、98度20s、從左到右退火溫度（67、63、60、55）30s、72度30s，、72度5min。 marker右邊四道是將1*PCR stimulant 換成8%DMSO ,體系和上面一樣 25ul，程序、退火溫度也同上述一直。 沒有任何目標條帶，預期產(chǎn)物500bp 只有最下面兩條不知道是什么 后來看到DMSO需要改進引物濃度。 就又了配置一次體系 圖2左邊兩道是陰陽性對照（陽性16S），marker中間的三條道為 FastPfu聚合酶（2%DMSO、0.2uM）（6%DMSO、0.6uM）（10%DMSO、0.8uM），未加PCR stimulant ，程序同上，用了56度退火溫度 。 右邊三道為TAKARA的EX taq酶，體系程序同上(60度退火溫度)，還是只有下面兩條帶，沒有預期500bp條帶 電泳是1%gel 我現(xiàn)在懷疑是我擴增區(qū)域模板形成了穩(wěn)定的二級結構，引物根本沒有和目的區(qū)域結合 有沒有大神告訴一下我該怎么辦 這幾天的辛酸歷程 寫的有點亂 有什么不懂得我在補充 IMG_20200909_122537.jpg IMG_20200909_180514.jpg 8ST~NIKA{DGZHX{}F7(P_UP.png |
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3樓2020-09-10 19:12:33
junjieshao
禁蟲 (小有名氣)
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華農(nóng)食品123(金幣+1): 謝謝參與
華農(nóng)食品123(金幣+1): 謝謝參與
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4樓2020-09-11 04:24:01
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