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華農(nóng)食品123

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[交流] PCR擴(kuò)增不出條帶，救救孩子吧

菌株：一株放線菌基因組GC含量較高，68.5%。
前期想通過重疊延伸PCR把上下游同源臂連起來，但一直沒有目的條帶，后面重新設(shè)計了一次引物，但只能擴(kuò)增出引物二聚體，這期間用了TaKaRa的 LA taq with GC buffer、EmeraldAmp® PCR Master Mix以及全式金的TransStart® FastPfu DNA Polymerase 結(jié)果都是要么沒有條帶要么都是引物二聚體，體系都是25ul，也嘗試過加入DMSO 也不行，但這個菌的16S用上述酶都能擴(kuò)增出來。
后來考慮到重疊延伸PCR引物的酶切修飾重疊部分可能對二聚體、擴(kuò)增有影響，就隨便從基因組上挑選了一個片段用oligo設(shè)計了一個評分都很好的引物（見圖），也blast過特異性，引物合成單上Tm值都是63度左右，就想驗證一下我這個菌到底能不能擴(kuò)增片段

圖片1中左邊第一道是提取基因組 DL5000 MARKER（從下往上是100、200 500、750bp）左邊是FastPfu 體系25ul（引物 0.2uM 模板 150ng 酶0.5ul 1*PCR stimulant 用于擴(kuò)增富含GC/復(fù)雜模板）。程序：98度3min、98度20s、從左到右退火溫度（67、63、60、55）30s、72度30s，、72度5min。 marker右邊四道是將1*PCR stimulant 換成8%DMSO ,體系和上面一樣 25ul，程序、退火溫度也同上述一直。沒有任何目標(biāo)條帶，預(yù)期產(chǎn)物500bp 只有最下面兩條不知道是什么

后來看到DMSO需要改進(jìn)引物濃度。就又了配置一次體系圖2左邊兩道是陰陽性對照（陽性16S），marker中間的三條道為 FastPfu聚合酶（2%DMSO、0.2uM）（6%DMSO、0.6uM）（10%DMSO、0.8uM），未加PCR stimulant ，程序同上，用了56度退火溫度。右邊三道為TAKARA的EX taq酶，體系程序同上(60度退火溫度)，還是只有下面兩條帶，沒有預(yù)期500bp條帶

電泳是1%gel

我現(xiàn)在懷疑是我擴(kuò)增區(qū)域模板形成了穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)，引物根本沒有和目的區(qū)域結(jié)合

有沒有大神告訴一下我該怎么辦

這幾天的辛酸歷程寫的有點亂有什么不懂得我在補充

IMG_20200909_122537.jpg

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1樓 2020-09-09 20:25:13

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守望者047

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華農(nóng)食品123(金幣+1): 謝謝參與

目的條帶不大的話，建議合成，節(jié)約時間�；蛘咴囋囍Z唯贊的pan mix

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2樓2020-09-10 14:02:25

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華農(nóng)食品123

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2樓: Originally posted by 守望者047 at 2020-09-10 14:02:25
目的條帶不大的話，建議合成，節(jié)約時間�；蛘咴囋囍Z唯贊的pan mix

同源臂加起來差不多1200bp，就算這個合成，后面做PCR相關(guān)的實驗還是不行。

目前覺得是模板自己形成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)，沒有和引物結(jié)合。

今天試了先把模板變性再加入體系，擴(kuò)出來條帶卻不是我的預(yù)期大小

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3樓2020-09-10 19:12:33

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junjieshao

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4樓2020-09-11 04:24:01

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謝謝您的回復(fù)

我前期是想擴(kuò)增同源臂的，然后SOE-PCR連起來

但后來一直擴(kuò)不出來，換了引物也擴(kuò)不出，后來考慮到重疊延伸PCR引物的酶切修飾重疊部分可能對二聚體、擴(kuò)增有影響

所以就設(shè)計了一個評分較好，無任何修飾的引物任何去擴(kuò)增一段片段，看是否能成功

圖中就是新引物的擴(kuò)增結(jié)果還是沒有擴(kuò)增條帶，更沒有我預(yù)期的條帶（500bp）

現(xiàn)在就是不知道為什么，總感覺還是模板和引物沒有結(jié)合的問題

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5樓2020-09-11 14:23:54

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4樓: Originally posted by junjieshao at 2020-09-11 04:24:01
沒看懂，
你是要先PCV擴(kuò)增出上游和下游同源臂，然后融合PCR連起來？
現(xiàn)在是上下游同源臂PCR出不來？

回復(fù)您了，在五樓

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6樓2020-09-11 14:27:00

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junjieshao

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7樓2020-09-11 22:01:00

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2011sp

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引物Tm值太低了，設(shè)計80度的再做

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8樓2020-09-12 09:08:54

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7樓: Originally posted by junjieshao at 2020-09-11 22:01:00
試過巢氏嗎，可能模板量小。
菌的DNA使用試劑盒抽提的？16s可能豐度高容易PCR。...

巢式還沒試過

基因組使用生工試劑盒提取的，濃度150ng/ul，A260/A280 2.0

感覺還是引物的問題

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10樓2020-09-12 22:17:06

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jurkat.1640

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Pfu擴(kuò)增效率低，有時候Taq能擴(kuò)增的片段，Pfu擴(kuò)增不出來

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12樓2020-09-14 14:07:19

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zhouxfd

木蟲 (正式寫手)

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你這個是GC含量的問題，換一個酶就好了

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13樓2020-09-23 09:28:15

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簡單回復(fù)

tzynew9樓

2020-09-12 18:53 回復(fù)

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miaojiabing11樓

2020-09-14 08:33 回復(fù)

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nono200914樓

2021-10-01 23:33 回復(fù)

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刀劈三關(guān)15樓

2021-10-04 21:36 回復(fù)

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