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細(xì)胞污染的種類及檢測方法 已有2人參與
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（一）細(xì)菌、真菌污染的檢測 1.肉眼觀察 細(xì)菌、真菌污染常在傳代、換液、加樣等開放性操作之后發(fā)生，而且增生迅速，若有污染，在48小時內(nèi)可明顯觀察到。 2.接種觀察 采用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養(yǎng)液接種，也可發(fā)現(xiàn)是否有污染。 3.顯微鏡下觀察 在倒置顯微鏡的高倍鏡下可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒漂浮，即為細(xì)菌污染；若細(xì)胞之間有絲狀、管狀、樹枝狀或卵形的物質(zhì)常為真菌污染。 （二）桿菌污染檢測 1.顯微鏡下觀察 在倒置顯微鏡的高倍鏡下可見培養(yǎng)液中有大量桿狀游動的小蟲子，前期培養(yǎng)液不渾濁，對各種抗生素?zé)o效，難以清除，換掖沖洗后也無效。 2.測序驗證 取適量培養(yǎng)液提基因組送測序，然后分析測序結(jié)果判斷為桿菌污染。 （三）支原體污染的檢測 1.顯微鏡觀察 直接取少許培養(yǎng)液滴在載物片上，再蓋上蓋片觀察，支原體在鏡下呈黑色微小顆粒，多位于細(xì)胞與細(xì)胞之間。應(yīng)注意與細(xì)胞破碎溢出的內(nèi)容物如線粒體等區(qū)別開來。 2.PCR檢測（MycoTest™ Kit） 利用降落聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（TD-PCR）對支原體16S rRNA 基因高度保守區(qū)域特異性片段進(jìn)行擴增檢測。如果有支原體污染即可在400～600bp左右能看到一條很亮的條帶。 該方法優(yōu)點：快速，特異性強適用于一般實驗室支原體檢測預(yù)防。 3.ERA檢測（先達(dá)基因） 用酶促重組等溫擴增技術(shù)（ERA技術(shù)）和單分子熒光檢驗技術(shù)（SM@RT），在恒定溫度（37℃）下可對特異基因進(jìn)行擴增及定性檢測，通過實時熒光擴增曲線，在20分鐘內(nèi)即可判斷樣品中是否含特異基因，檢測過程無需開蓋，避免氣溶膠的產(chǎn)生，結(jié)果可靠性大幅度提高。 4.熒光染色法觀察 用熒光染料與DNA特異地結(jié)合，可使支原體內(nèi)的DNA著色，熒光顯微鏡下支原體成綠色小點，散于細(xì)胞周圍或附于細(xì)胞表面。 5.電鏡檢測 若條件許可，可用掃描電鏡或投射電鏡觀察。一般在細(xì)胞培養(yǎng)48-72小時，細(xì)胞接近匯合前，用胰酶消化細(xì)胞制成細(xì)胞懸液后進(jìn)行固定、包埋、切片后才能進(jìn)行觀察。 6.培養(yǎng)檢測 將細(xì)胞懸液5mL加入45mL支原體肉湯培養(yǎng)基，培養(yǎng)14天后觀察肉湯培養(yǎng)基有無霧狀沉淀，然后取0.5mL加入已冷卻到50℃的培養(yǎng)基中，再用瓊脂培養(yǎng)基做分離培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)3天觀察有無“荷包蛋”菌落出現(xiàn)。 （四）黑膠蟲污染的檢測 1.顯微鏡觀察 在顯微鏡的高倍鏡下可見培養(yǎng)液中有小黑點狀顆粒，并在原點做布朗運動或震動，即為大致判斷為黑膠蟲污染。黑膠蟲比細(xì)胞體積小很多，主要分布在細(xì)胞間隙。 黑膠蟲污染前期細(xì)胞無明顯變化，培養(yǎng)液中有少許做布朗運動的小黑點，污染后期小黑點會迅速增殖導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)裂解死亡。細(xì)胞勤換液可以稍微緩解黑膠蟲增殖速度，但無法擺脫污染。 2.PCR檢測 利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR）對黑膠蟲基因組進(jìn)行特異性擴增檢測。 4.ERA檢測 用酶促重組等溫擴增技術(shù)（ERA技術(shù)）對齊基因組進(jìn)行特異性等溫擴增檢測 （五）病毒的檢測 1.應(yīng)用電鏡技術(shù)快速診斷動物病毒病。 2.逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RT-PCR檢測病毒。 3.酶促重組等溫擴增檢測病毒。 |
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3樓2020-09-16 14:55:51
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