 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 1 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 2587 | 回復(fù): 0 | |||
蟲蟲蟲蟲小新蟲 (初入文壇)
|
[交流]
科研人必做實(shí)驗(yàn)之EMSA
|
|
EMSA又稱作凝膠遷移實(shí)驗(yàn)，這是每個(gè)實(shí)驗(yàn)者的必做實(shí)驗(yàn)��！是一種用于蛋白與核算相互作用的技術(shù)。最初是用于轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子相互作用的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，也可應(yīng)用與蛋白-DNA、蛋白-RNA互作研究。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br /> 凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（EMSA）可以：（1）研究DNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA結(jié)合序列相互作用；（2）可用于DNA定性和定量分析；（3）用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。 實(shí)驗(yàn)過(guò)程： 一、樣品的制備：包括探針的標(biāo)記準(zhǔn)備，探針的純化和凝膠的制備 1、探針的標(biāo)記準(zhǔn)備： （1）如下設(shè)置探針標(biāo)記的反應(yīng)體系：總體積 10微升 待標(biāo)記探針 （1.75pmol/微升） 2微升 T4 Polynucleotide Kinase Buffer （10X） 1微升 Nuclease-Free Water 5微升 [γ-32P]ATP（3,000Ci/mmol at 10mCi/ml） 1微升 T4 Polynucleotide Kinase （5-10U/微升） 1微升 按照上述反應(yīng)體系依次加入各種試劑，加入同位素后，Vortex混勻，再加入T4 Polynucleotide Kinase，混勻。 （2） 使用水浴或PCR儀，37℃反應(yīng)10分鐘。 （3） 加入1微升探針標(biāo)記終止液，混勻，終止探針標(biāo)記反應(yīng)。 （4） 再加入89微升TE,混勻。此時(shí)可以取少量探針用于檢測(cè)標(biāo)記的效率。通常標(biāo)記的效率在30%以上，即總放射性的30%以上標(biāo) 記到了探針上。為實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)便起見(jiàn)，通常不必測(cè)定探針的標(biāo)記效率。 （5） 標(biāo)記好的探針最好立即使用，最長(zhǎng)使用時(shí)間一般不宜超過(guò)3天。標(biāo)記好的探針可以保存在-20℃。 二、探針的純化： 通常為實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)便起見(jiàn)，可以不必純化標(biāo)記好的探針。在有些時(shí)候，純化后的探針會(huì)改善EMSA的電泳結(jié)果。如需純化，可以按照如 下步驟操作： （1） 對(duì)于100微升標(biāo)記好的探針，加入1/4體積即25微升的5M醋酸銨，再加入2體積即200微升的無(wú)水乙醇，混勻。 （2） 在-70℃至-80℃沉淀1小時(shí)，或在-20℃沉淀過(guò)夜。 （3） 在4℃，12000g-16000g離心30分鐘。小心去除上清，切不可觸及沉。 （4） 在4℃，12000g-16000g離心1分鐘。小心吸去殘余液體。微晾干沉淀，但不宜過(guò)分干燥。 （5） 加入100微升TE，完全溶解沉淀。標(biāo)記好的探針最好立即使用，最長(zhǎng)使用時(shí)間一般不宜超過(guò)3天。標(biāo)記好的探針可以保存于-20℃。 三、凝膠的制備： （1） 制備6.5%非變性聚丙烯酰胺凝膠：（注意根據(jù)試劑情況按比例調(diào)整總體積） 5XTBE 1ml 30%Acrylamide/Bis 2.2ml deionized,sterilewater 6.62ml 80%Glycerol（甘油） 80μl 10%AP（硫酸氨） 90μl TEMED（四甲基乙二氨） 10μl 總體積 10ml （2）按標(biāo)準(zhǔn)步驟制備凝膠。 （3）加樣前先在預(yù)冷的0.5X TBE buffer中120V預(yù)電泳10min，與電泳完畢后沖洗加樣孔。 （4）混合樣本及電泳緩沖液，點(diǎn)樣電泳。 （5）將電泳槽置于冰上或者4℃環(huán)境中，恒壓100V進(jìn)行電泳，直至緩沖液指示帶距離凝膠底部2~3cm為止。（大約50-60min，根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整電泳時(shí)間及電壓；電泳時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)） EMSA的結(jié)合： 1、設(shè)置如下EMSA結(jié)合反應(yīng) 陰性對(duì)照反應(yīng)： （1）Nuclease-Free Water ：7微升。 （2）EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) ：2微升。 （3）細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子： 0微升。 （4）標(biāo)記好的探針 ：1微升。 （5）總體積 ：10微升。 樣品反應(yīng)： （1）Nuclease-Free Water ：5微升。 （2）EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) ：2微升。 （3）細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 ：2微升。 （4）標(biāo)記好的探針： 1微升。 （5）總體積： 10微升。 探針冷競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)： （1）Nuclease-Free Water ：4微升。 （2）EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) ：2微升。 （3）細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子： 2微升。 （4）未標(biāo)記的探針： 1微升。 （5）標(biāo)記好的探針： 1微升。 （6）總體積 ：10微升。 突變探針的冷競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)： （1）Nuclease-Free Water ：4微升。 （2）EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) ：2微升。 （3）細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 ：2微升。 （4）未標(biāo)記的突變探針： 1微升。 （5）標(biāo)記好的探針： 1微升。 （6）體積 ：10微升。 Super-shift反應(yīng)： （1）Nuclease-Free Water：4微升。 （2）EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) ：2微升。 （3）細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子：2微升。 （4）目的蛋白特異抗體 ：1微升。 （5）標(biāo)記好的探針：1微升。 （6）總體積 ：10微升。 2、加入標(biāo)記好的探針前先混勻，并且室溫 （20～25 ℃） 放置 10 分鐘，從而消除可能發(fā)生的探針和蛋白的非特異性結(jié)合，或讓冷探針優(yōu)先反應(yīng)。然后加入標(biāo)記好的探針，混勻，室溫放置 20 分鐘。 3、加入1微升EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液(無(wú)色，10X)，混勻后立即上樣。 電泳分析： 1、用0.5XTBE作為電泳液。按照10V/厘米的電壓預(yù)電泳10分鐘。預(yù)電泳的時(shí)候如果有空余的上樣孔，可以加入少量稀釋好的1X 的EMSA上樣緩沖液(藍(lán)色)，以觀察電壓是否正常進(jìn)行。 2、把混合了上樣緩沖液的樣品加入到上樣孔內(nèi)。在多余的某個(gè)上樣孔內(nèi)加入10微升稀釋好的1X的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液 (藍(lán)色)，用于觀察電泳進(jìn)行的情況。 3、按照10 V/厘米的電壓電泳。確保膠的溫度不超過(guò)30℃，如果溫度升高，需要適當(dāng)降低電壓。電泳至EMSA/Gel-Shift上樣緩 沖液中的藍(lán)色染料溴酚藍(lán)至膠的下緣1/4處，停止電泳。 4、剪一片大小和EMSA膠大小相近或略大的比較厚實(shí)的濾紙。小心取下夾有EMSA膠的膠板，用吸水紙或普通草紙大致擦干膠板邊 緣的電壓液。小心打開(kāi)兩塊膠板中的上面一塊(注：通常選擇先移走硅烷化的那塊玻璃板)，把濾紙從EMSA膠的一側(cè)逐漸覆蓋住整個(gè)EMSA膠，輕輕把濾紙和膠壓緊。濾紙被膠微微浸濕后(大約不足1分鐘)，輕輕揭起濾紙，這時(shí)EMSA膠會(huì)被濾紙一起揭起來(lái)。把濾紙側(cè)向下，放平，在EMSA膠的上面覆蓋一層保鮮膜，確保保鮮膜和膠之間沒(méi)有氣泡。 5、 干膠儀器上干燥EMSA膠。然后用X光片壓片檢測(cè)，或用其它適當(dāng)儀器設(shè)備檢測(cè)。 |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：實(shí)驗(yàn)器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：和實(shí)驗(yàn)材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤(rùn)色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有219人回復(fù)
-
蛋白質(zhì)檢測(cè)：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之小鼠實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)，解析生命機(jī)制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測(cè)：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測(cè)重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 蟲蟲蟲蟲小 的主題更新
| 1 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 085600 材料與化工 295 求調(diào)劑 +6 | dream…… 2026-03-10 | 6/300 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] A區(qū)一本交叉課題組，低分調(diào)劑，招收機(jī)械電子信息通信等交叉方向 +56 | lisimayy 2026-03-04 | 73/3650 |
|
|
|
[考研] 材料與化工，291，求調(diào)劑 +12 | 咕嚕咕嚕123123 2026-03-05 | 13/650 |
|
|
[考研] 282分材料專業(yè)求調(diào)劑院校 +14 | 楓橋ZL 2026-03-09 | 20/1000 |
|
|
|
[考研] 085600材料與化工 326 求調(diào)劑 +4 | 熱愛(ài)生活ing 2026-03-09 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 調(diào)劑 +4 | 調(diào)劑的考研學(xué)生 2026-03-09 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 考研調(diào)劑，一志愿山東大學(xué)材料與化工，328分，政治51 +5 | 關(guān)你西紅柿929 2026-03-08 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 296求調(diào)劑 +4 | Xinyu Wu311 2026-03-09 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 290 材料與化工求調(diào)劑 +7 | Nebulala 2026-03-08 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 考研求調(diào)劑，工科，總分304 +4 | 矮子不想長(zhǎng)高了 2026-03-08 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 材料化工求調(diào)劑 +7 | 博斯特525 2026-03-06 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 材料277分求調(diào)劑 +13 | 飯飯星球 2026-03-04 | 14/700 |
|
|
|
[考研] 一志愿武理085601專碩347分求調(diào)劑 +4 | 啊歐歐歐 2026-03-04 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 334求調(diào)劑 +3 | Trying] 2026-03-03 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 301求調(diào)劑 +4 | 李LJR 2026-03-04 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 304求調(diào)劑 +3 | 曼殊2266 2026-03-04 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 0856材料專碩274能調(diào)劑去哪里？ +3 | 22735 2026-03-04 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 281求調(diào)劑 +3 | 我是小小蔥蔥 2026-03-03 | 5/250 |
|
|
|
[考研]
 0703化學(xué)學(xué)碩 288分
+4
|
旅行中的紫葡萄 2026-03-03 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 298求調(diào)劑一志愿中海洋 +3 | lour. 2026-03-03 | 3/150 |
|