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蟲蟲蟲蟲小新蟲 (初入文壇)
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科研人必做實(shí)驗(yàn)之EMSA
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EMSA又稱作凝膠遷移實(shí)驗(yàn)，這是每個(gè)實(shí)驗(yàn)者的必做實(shí)驗(yàn)�。∈且环N用于蛋白與核算相互作用的技術(shù)。最初是用于轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子相互作用的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，也可應(yīng)用與蛋白-DNA、蛋白-RNA互作研究。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br /> 凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（EMSA）可以：（1）研究DNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA結(jié)合序列相互作用；（2）可用于DNA定性和定量分析；（3）用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。 實(shí)驗(yàn)過程： 一、樣品的制備：包括探針的標(biāo)記準(zhǔn)備，探針的純化和凝膠的制備 1、探針的標(biāo)記準(zhǔn)備： （1）如下設(shè)置探針標(biāo)記的反應(yīng)體系：總體積 10微升 待標(biāo)記探針 （1.75pmol/微升） 2微升 T4 Polynucleotide Kinase Buffer （10X） 1微升 Nuclease-Free Water 5微升 [γ-32P]ATP（3,000Ci/mmol at 10mCi/ml） 1微升 T4 Polynucleotide Kinase （5-10U/微升） 1微升 按照上述反應(yīng)體系依次加入各種試劑，加入同位素后，Vortex混勻，再加入T4 Polynucleotide Kinase，混勻。 （2） 使用水浴或PCR儀，37℃反應(yīng)10分鐘。 （3） 加入1微升探針標(biāo)記終止液，混勻，終止探針標(biāo)記反應(yīng)。 （4） 再加入89微升TE,混勻。此時(shí)可以取少量探針用于檢測(cè)標(biāo)記的效率。通常標(biāo)記的效率在30%以上，即總放射性的30%以上標(biāo) 記到了探針上。為實(shí)驗(yàn)簡便起見，通常不必測(cè)定探針的標(biāo)記效率。 （5） 標(biāo)記好的探針最好立即使用，最長使用時(shí)間一般不宜超過3天。標(biāo)記好的探針可以保存在-20℃。 二、探針的純化： 通常為實(shí)驗(yàn)簡便起見，可以不必純化標(biāo)記好的探針。在有些時(shí)候，純化后的探針會(huì)改善EMSA的電泳結(jié)果。如需純化，可以按照如 下步驟操作： （1） 對(duì)于100微升標(biāo)記好的探針，加入1/4體積即25微升的5M醋酸銨，再加入2體積即200微升的無水乙醇，混勻。 （2） 在-70℃至-80℃沉淀1小時(shí)，或在-20℃沉淀過夜。 （3） 在4℃，12000g-16000g離心30分鐘。小心去除上清，切不可觸及沉。 （4） 在4℃，12000g-16000g離心1分鐘。小心吸去殘余液體。微晾干沉淀，但不宜過分干燥。 （5） 加入100微升TE，完全溶解沉淀。標(biāo)記好的探針最好立即使用，最長使用時(shí)間一般不宜超過3天。標(biāo)記好的探針可以保存于-20℃。 三、凝膠的制備： （1） 制備6.5%非變性聚丙烯酰胺凝膠：（注意根據(jù)試劑情況按比例調(diào)整總體積） 5XTBE 1ml 30%Acrylamide/Bis 2.2ml deionized,sterilewater 6.62ml 80%Glycerol（甘油） 80μl 10%AP（硫酸氨） 90μl TEMED（四甲基乙二氨） 10μl 總體積 10ml （2）按標(biāo)準(zhǔn)步驟制備凝膠。 （3）加樣前先在預(yù)冷的0.5X TBE buffer中120V預(yù)電泳10min，與電泳完畢后沖洗加樣孔。 （4）混合樣本及電泳緩沖液，點(diǎn)樣電泳。 （5）將電泳槽置于冰上或者4℃環(huán)境中，恒壓100V進(jìn)行電泳，直至緩沖液指示帶距離凝膠底部2~3cm為止。（大約50-60min，根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整電泳時(shí)間及電壓；電泳時(shí)間不宜過長） EMSA的結(jié)合： 1、設(shè)置如下EMSA結(jié)合反應(yīng) 陰性對(duì)照反應(yīng)： （1）Nuclease-Free Water ：7微升。 （2）EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) ：2微升。 （3）細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子： 0微升。 （4）標(biāo)記好的探針 ：1微升。 （5）總體積 ：10微升。 樣品反應(yīng)： （1）Nuclease-Free Water ：5微升。 （2）EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) ：2微升。 （3）細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 ：2微升。 （4）標(biāo)記好的探針： 1微升。 （5）總體積： 10微升。 探針冷競爭反應(yīng)： （1）Nuclease-Free Water ：4微升。 （2）EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) ：2微升。 （3）細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子： 2微升。 （4）未標(biāo)記的探針： 1微升。 （5）標(biāo)記好的探針： 1微升。 （6）總體積 ：10微升。 突變探針的冷競爭反應(yīng)： （1）Nuclease-Free Water ：4微升。 （2）EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) ：2微升。 （3）細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 ：2微升。 （4）未標(biāo)記的突變探針： 1微升。 （5）標(biāo)記好的探針： 1微升。 （6）體積 ：10微升。 Super-shift反應(yīng)： （1）Nuclease-Free Water：4微升。 （2）EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) ：2微升。 （3）細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子：2微升。 （4）目的蛋白特異抗體 ：1微升。 （5）標(biāo)記好的探針：1微升。 （6）總體積 ：10微升。 2、加入標(biāo)記好的探針前先混勻，并且室溫 （20～25 ℃） 放置 10 分鐘，從而消除可能發(fā)生的探針和蛋白的非特異性結(jié)合，或讓冷探針優(yōu)先反應(yīng)。然后加入標(biāo)記好的探針，混勻，室溫放置 20 分鐘。 3、加入1微升EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液(無色，10X)，混勻后立即上樣。 電泳分析： 1、用0.5XTBE作為電泳液。按照10V/厘米的電壓預(yù)電泳10分鐘。預(yù)電泳的時(shí)候如果有空余的上樣孔，可以加入少量稀釋好的1X 的EMSA上樣緩沖液(藍(lán)色)，以觀察電壓是否正常進(jìn)行。 2、把混合了上樣緩沖液的樣品加入到上樣孔內(nèi)。在多余的某個(gè)上樣孔內(nèi)加入10微升稀釋好的1X的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液 (藍(lán)色)，用于觀察電泳進(jìn)行的情況。 3、按照10 V/厘米的電壓電泳。確保膠的溫度不超過30℃，如果溫度升高，需要適當(dāng)降低電壓。電泳至EMSA/Gel-Shift上樣緩 沖液中的藍(lán)色染料溴酚藍(lán)至膠的下緣1/4處，停止電泳。 4、剪一片大小和EMSA膠大小相近或略大的比較厚實(shí)的濾紙。小心取下夾有EMSA膠的膠板，用吸水紙或普通草紙大致擦干膠板邊 緣的電壓液。小心打開兩塊膠板中的上面一塊(注：通常選擇先移走硅烷化的那塊玻璃板)，把濾紙從EMSA膠的一側(cè)逐漸覆蓋住整個(gè)EMSA膠，輕輕把濾紙和膠壓緊。濾紙被膠微微浸濕后(大約不足1分鐘)，輕輕揭起濾紙，這時(shí)EMSA膠會(huì)被濾紙一起揭起來。把濾紙側(cè)向下，放平，在EMSA膠的上面覆蓋一層保鮮膜，確保保鮮膜和膠之間沒有氣泡。 5、 干膠儀器上干燥EMSA膠。然后用X光片壓片檢測(cè)，或用其它適當(dāng)儀器設(shè)備檢測(cè)。 |
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