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XM沐沐新蟲 (小有名氣)
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[求助]
關(guān)于質(zhì)粒重組，請教大佬們~ 已有2人參與
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| 合成的引物，退火用klenow fragment補齊，酶切后用T4連接酶插入到相同酶切的質(zhì)粒中，通過DH5α轉(zhuǎn)化，沒有菌落長出，是什么問題��？是質(zhì)粒重組沒有連接上么？ |
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雨獨步
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2樓2020-01-16 13:03:42
liling0601
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3樓2020-01-17 13:32:24
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【答案】應(yīng)助回帖
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導(dǎo)致沒有菌生長的原因有很多，比如，片段酶切處理不完全、載體處理不完全、連接效率過低、感受態(tài)細(xì)胞效率低下等等。如果想找到原因還是建議做一些對照實驗，比如可以用空載轉(zhuǎn)感受態(tài)，驗證感受態(tài)細(xì)胞效率，通過載體自連轉(zhuǎn)化驗證載體處理效果等。 大家經(jīng)常面對的是假陽性比較多，即載體自連。對于樓主出現(xiàn)的連一個菌都不長的情況，首先確定平板抗性正確，然后使用空載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，驗證感受態(tài)細(xì)胞的效率，當(dāng)然如果感受態(tài)細(xì)胞其他人用著可以，那就不用做該對照。 不太清楚樓主的實驗?zāi)康�，描述的比較簡單，且“合成的引物，退火用klenow fragment補齊”是pcr擴增基因產(chǎn)物？我沒做過，所以不太清楚表達(dá)的意思。 其實轉(zhuǎn)化的主要因素就是：片段、載體、連接體系 pcr片段進(jìn)行酶切時候，最容易出現(xiàn)酶切不完全的情況，因為切下來的堿基少，電泳無法分辨�？梢钥紤]連接T載體后，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切，這樣可以通過電泳檢測片段是否酶切完全。 載體也同樣存在酶切是否完全的問題，特別雙酶切的時候，很多判斷是否兩個酶都酶切完全。這時候我們一般會適當(dāng)?shù)脑黾用噶亢蜁r間，但這一般不會導(dǎo)致一個菌都不長，會出現(xiàn)載體自連情況。 接下來就是連接，我建議在進(jìn)行片段和載體連接前，一定進(jìn)行電泳檢測你的片段和載體濃度，因為我們之前就出現(xiàn)過，對片段載體膠回收后進(jìn)行連接效率很低，后來發(fā)現(xiàn)回收的片段濃度電泳都看不到，所以根據(jù)經(jīng)驗，還是做個電泳檢測，如果片段濃度可以，那就盡量多的加入片段，載體有一點即可，可以增加轉(zhuǎn)化子的陽性數(shù)。 |
4樓2020-04-08 14:26:18
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