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Western Blot（WB）操作中需要注意事項(xiàng)與結(jié)果不理想可能的原因自查
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第一部分 WB操作中需要注意事項(xiàng) 一、蛋白樣品的準(zhǔn)備 1、樣品質(zhì)量 所抽取樣品的蛋白含量，蛋白變性是否充分等等，還有，蛋白樣品的PH值是否在7~8之間。這會(huì)直接影響到樣品濃縮的效果。此外，蛋白樣品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都會(huì)對(duì)最終結(jié)果的可靠性有影響。 2、細(xì)胞水平要做WB，多少細(xì)胞提的蛋白夠做WB 一般5×106就足夠 3、小分子量蛋白10KD需要的注意點(diǎn) 1）可選擇孔徑0.22um的PVDF膜或者NC膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間縮短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE體系 2）也可以選擇PSQ膜，同時(shí)縮短轉(zhuǎn)移時(shí)間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉(zhuǎn)移。其他按步驟即可 4、大分子量蛋白200KD需要的注意點(diǎn) 1）做200kd蛋白的WB時(shí)要注意，分離膠最好選擇>7%的；剝膠時(shí)要小心 2）轉(zhuǎn)移時(shí)間需要相應(yīng)延長(zhǎng)；要做分子量參照（否則出現(xiàn)雜帶不知道如何分析） 3）轉(zhuǎn)膜液中甲醇含量可適當(dāng)降低，推薦使用濕裝轉(zhuǎn)膜效率更高 二、制膠 1、凝膠質(zhì)量 不連續(xù)SDS-PAGE膠對(duì)凝膠的要求較高，分離膠的PH值應(yīng)在8.8左右，而濃縮膠的PH應(yīng)在6.8左右，最好不要差過0.5個(gè)PH單位，因?yàn)檫@個(gè)PH條件是保證電泳液中的甘氨酸不電離的必要條件，也是保證能充分壓縮樣品的前提。因此，制備凝膠的時(shí)候所用Tris-HCl緩沖液的PH值是否穩(wěn)定是很重要的。 2、在用ddH2O壓分離膠的時(shí)候?yàn)槭裁唇?jīng)常存在中間凸的現(xiàn)象 1）加水時(shí)不能對(duì)著膠沖，要沿著玻璃板緩慢流行 2）加水滿后一定要保證上方水平面是平齊的 3）加膠要避免氣泡，也要避免加膠太慢而提前凝固等現(xiàn)象 4）有其他人的經(jīng)驗(yàn)是用異丙醇封膠封膠后左右晃一下 三、加樣 1、點(diǎn)樣 樣品盡量不要與電泳液混合，這樣能提高濃縮的效果，因?yàn)殡娪疽篜H值為8.3，而樣品為7.5，混合后會(huì)影響到樣品的PH值，進(jìn)而影響濃縮效果。因此，建議點(diǎn)樣最好用長(zhǎng)槍頭，或者加樣器，輕輕的將樣品加到孔的底部。 2、如果上樣量超載，要用什么方法來增加上樣量 可以濃縮樣品，也可以根據(jù)目標(biāo)分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載30％是不會(huì)有問題的。如果已經(jīng)超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可以試試1.5mm的。 四、電泳 1、電泳緩沖液 盡量用新鮮配制的。這樣能保證PH值和離子強(qiáng)度的穩(wěn)定 2、電壓條件 我們經(jīng)常用的濃縮時(shí)80V，分離時(shí)100V比較好，條帶很平 3、轉(zhuǎn)膜 膜的選擇主要從實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?shí)驗(yàn)要求來考慮。例如，要做分子量小于20kD的小蛋白，0.45μm的NC膜是不可取的，因?yàn)檫@樣可能會(huì)使得蛋白因透過膜孔而造成膜結(jié)合的目的蛋白量不確定，從而影響到最終結(jié)果的可靠性。而如果所分離的蛋白需要進(jìn)行測(cè)序，則非PVDF膜不可，因?yàn)橹挥蠵VDF膜才能經(jīng)受住嚴(yán)酷的清洗條件。 五、封閉 1、封閉液的選用要求 1）常用封閉液為脫脂牛奶（光明或伊利等）、牛血清白蛋白（BSA）、無蛋白封閉液等 2) 封閉液濃度：封閉時(shí)一般用5%脫脂牛奶，也可用1-5%BSA或1%無蛋白封閉液；配制二抗稀釋液一般為1-5%脫脂牛奶，全部用PBS稀釋 3) 封閉時(shí)間：室溫1-2h、4度過夜或37度半小時(shí) 4) 封閉液pH：一般5%脫脂牛奶pH大約為6.0-6.5左右，而1%脫脂牛奶可能6.5-7，好像RD公司的WB-Protocol中要求封閉液和稀釋抗體的封閉液需要調(diào)pH至7.4；但是大多數(shù)抗體不調(diào)pH也可以做出來 5) 個(gè)人經(jīng)驗(yàn)：5%脫脂牛奶封閉效果最佳，但有時(shí)也可能封閉過度，可以與BSA或無蛋白封閉液輪流更換 六、顯色 1、抗體雜交與底物顯色 一抗盡量選擇小鼠或者兔來源的單克隆抗體，還有要注意所用的抗體是否能夠識(shí)別變性條件下的目標(biāo)蛋白；二抗一般都是效價(jià)很高的，只要室溫下雜交1小時(shí)就可以了，適當(dāng)延長(zhǎng)也是可以的。另外，要選擇靈敏度較高的化學(xué)反應(yīng)底物。 2、WB中抗體的可以重復(fù)應(yīng)用嗎 答：抗體工作溶液一般不主張儲(chǔ)存反復(fù)使用，但是如抗體比較珍貴，可反復(fù)使用2－3次。稀釋后應(yīng)在2－3天內(nèi)使用，4度保存，避免反復(fù)凍融。 3、免疫組化和WB可以用同一種抗體嗎 答：免疫組化時(shí)抗體識(shí)別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇（又稱表位），有些表位是線性的，而有的屬于構(gòu)象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構(gòu)象型表位由于受蛋白空間結(jié)構(gòu)限制，煮后變性會(huì)消失。如果所用的抗體識(shí)別的是蛋白上連續(xù)的幾個(gè)氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時(shí)用于免疫組化和WB，而如果抗體識(shí)別構(gòu)象形表位，則只能用于免疫組化。 第二部分 WB結(jié)果不理想可能的原因自查 從結(jié)果倒推操作過程中可能的問題，總的來說，WB結(jié)果不理想，可能的問題主要集中在以下幾方面部分： 1、陰性結(jié)果的原因 1) 二抗條件過低：提高二抗?jié)舛�、延長(zhǎng)二抗孵育時(shí)間或孵育溫度 2) 一抗條件過低：提高一抗?jié)舛取⒀娱L(zhǎng)一抗孵育時(shí)間或孵育溫度 3) 抗原過少：提高上樣量 4) 抗體種屬不兼容：一抗species reactivity中是否有需要檢測(cè)樣品的種屬來源，一抗與二抗是否相匹配 5) 酶活性：二抗上標(biāo)記的HRP或AP等酶活性降低，如抗體過期或反復(fù)化凍等 6) 封閉過度或封閉劑不兼容：降低封閉劑濃度、縮短封閉時(shí)間，或者更換封閉劑種類 7) 底物出現(xiàn)質(zhì)量問題：可以通過點(diǎn)雜交試驗(yàn)排除底物和酶活性問題 8) 抗體稀釋液pH：注意檢測(cè)pH是否在6-8 9）樣品不表達(dá)該目的蛋白 10）轉(zhuǎn)膜不足或過頭：優(yōu)化轉(zhuǎn)膜條件 11）其它：PVDF膜、保鮮膜質(zhì)量問題等 12）抗體質(zhì)量：換興譽(yù)好的品牌抗體公司，如CST、Millipore、Abcam等 2、有雜帶或背景的原因 1）目的蛋白有多個(gè)修飾位點(diǎn)，本身可以呈現(xiàn)多條帶，建議查閱文獻(xiàn)或進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得蛋白序列的修飾位點(diǎn)信息，通過去修飾確定蛋白實(shí)際大小 2) 樣本處理過程中目的蛋白發(fā)生降解,建議加入蛋白酶抑制劑；樣本處理時(shí)在冰上操作 3）二聚體或多聚體存在，建議增加蛋白質(zhì)變性過程及強(qiáng)度 4）上樣量過高：降低上樣量，減少抗原含量 5）二抗條件過強(qiáng)：降低二抗?jié)舛�、縮短二抗孵育時(shí)間或改變溫度等 6）一抗條件過強(qiáng)：降低一抗?jié)舛�、縮短一抗孵育時(shí)間和改變溫度等 7）抗體質(zhì)量不佳：如特異性不好，建議購買品牌公司的抗體 8）一抗稀釋度不適宜，可以對(duì)抗體進(jìn)行滴度測(cè)試，選擇最適宜的抗體稀釋度 9）一抗孵育的溫度偏高，建議4℃結(jié)合過夜 10）抗體濃度過高或洗滌不夠，建議降低抗體濃度，增加洗滌次數(shù)和時(shí)間 11）膜清洗不全：增加清洗強(qiáng)度，如增加蕩洗次數(shù)、延長(zhǎng)清洗時(shí)間或加0.05-0.1%Tween 20等 11）ECL發(fā)光液本身因外源污染等原因存在很強(qiáng)的背景光，顯影可以顯示強(qiáng)的背景光，建議分裝A和B液和更換發(fā)光液 12）縮短壓片或曝光時(shí)間 13）膜沒有完全均勻濕透，建議使用100% methanol浸透膜 14）電極不平衡或者加樣位置偏斜，可以調(diào)整電極和加樣 15）封閉不全：二抗與抗原有交叉反應(yīng)，升高封閉劑濃度、延長(zhǎng)封閉時(shí)間或更換不同的封閉劑，孵育時(shí)保證封閉液完全浸沒轉(zhuǎn)印膜 16）封閉物使用不當(dāng)，比如檢測(cè)生物素標(biāo)記的蛋白時(shí)不可用脫脂奶粉封閉； 17）封閉時(shí)間不夠，一般情況下室溫37度封閉1小時(shí)以上或者4度封閉過夜 18）抗體非特異性結(jié)合，可以降低抗體濃度，減少孵育時(shí)間 19）化學(xué)顯色底物過多，建議按說明書加入適量的顯色底物 3、為啥條帶形狀不好看 1）膠凝的不均勻或聚合不好，建議灌膠前將溶液充分混勻 2）某些樣品鹽濃度較高，建議除鹽或?qū)悠符}濃度調(diào)成一致 3) 緩沖液陳舊，成分改變,可以重配 4) 凝膠下面有氣泡,電泳前要先將氣泡趕走 5）電泳時(shí)溫度過高，可以降低電流或電壓 6）樣品中含有不溶性顆粒，建議樣品充分?jǐn)嚢杌靹?br /> 4、蛋白條帶位置（大�。┎粚�(duì) 1）膠濃度不對(duì)，不同濃度的膠跑出的蛋白條帶的位置可能有所偏差，可以調(diào)整濃度 2）抗體孵育不充分,建議增加抗體濃度，延長(zhǎng)孵育時(shí)間 3）酶失活，建議直接將酶和底物進(jìn)行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內(nèi)、有活性的酶聯(lián)物 4）目的蛋白存在翻譯后修飾或剪切體，建議查詢相關(guān)文獻(xiàn)確定 5）標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低，建議設(shè)置陽性對(duì)照比對(duì)結(jié)果，增加標(biāo)本上樣量 5、背景有黑色斑點(diǎn)或不均勻的白色斑點(diǎn)和暗背景上白色帶 1）抗體與封閉試劑反應(yīng)，建議使用前過濾封閉試劑 2）HRP含量過高，建議降低酶聯(lián)二抗的濃度 3）HRP偶聯(lián)二抗中有聚集體，建議過濾二抗試劑，去除聚集體 4）抗體分布不均勻，建議孵育抗體時(shí)使用搖床 6、為什么我的細(xì)胞提取液中沒有檢測(cè)到目的蛋白 1）細(xì)胞中不表達(dá)這種蛋白質(zhì)，換一種細(xì)胞 2）抗體不能識(shí)別目標(biāo)蛋白，多看看說明，是否有問題 3）可能是沒有保持低溫操作，樣品保存不當(dāng)，樣品放置時(shí)間過長(zhǎng) 4）細(xì)胞中的蛋白質(zhì)被酶降解掉了，可加入蛋白酶抑制劑，抑制蛋白酶活性 7、我的目的帶很弱，如何加強(qiáng) 1）可以加大抗原上樣量，這是最主要的 2）也可以將一抗稀釋比例降低 3）還可以延長(zhǎng)曝光時(shí)間 以上內(nèi)容主要根據(jù)網(wǎng)絡(luò)信息收集，方便大家。當(dāng)然如果有拿不準(zhǔn)的，大家可以再繼續(xù)找找相關(guān)的信息，祝大家實(shí)驗(yàn)順利。 |
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 論文寫作 | WB檢測(cè) |
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2019-08-23 16:37
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