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Western Blot（WB）操作中需要注意事項與結果不理想可能的原因自查
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第一部分 WB操作中需要注意事項 一、蛋白樣品的準備 1、樣品質(zhì)量 所抽取樣品的蛋白含量，蛋白變性是否充分等等，還有，蛋白樣品的PH值是否在7~8之間。這會直接影響到樣品濃縮的效果。此外，蛋白樣品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都會對最終結果的可靠性有影響。 2、細胞水平要做WB，多少細胞提的蛋白夠做WB 一般5×106就足夠 3、小分子量蛋白10KD需要的注意點 1）可選擇孔徑0.22um的PVDF膜或者NC膜，轉(zhuǎn)膜時間縮短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE體系 2）也可以選擇PSQ膜，同時縮短轉(zhuǎn)移時間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉(zhuǎn)移。其他按步驟即可 4、大分子量蛋白200KD需要的注意點 1）做200kd蛋白的WB時要注意，分離膠最好選擇>7%的；剝膠時要小心 2）轉(zhuǎn)移時間需要相應延長；要做分子量參照（否則出現(xiàn)雜帶不知道如何分析） 3）轉(zhuǎn)膜液中甲醇含量可適當降低，推薦使用濕裝轉(zhuǎn)膜效率更高 二、制膠 1、凝膠質(zhì)量 不連續(xù)SDS-PAGE膠對凝膠的要求較高，分離膠的PH值應在8.8左右，而濃縮膠的PH應在6.8左右，最好不要差過0.5個PH單位，因為這個PH條件是保證電泳液中的甘氨酸不電離的必要條件，也是保證能充分壓縮樣品的前提。因此，制備凝膠的時候所用Tris-HCl緩沖液的PH值是否穩(wěn)定是很重要的。 2、在用ddH2O壓分離膠的時候為什么經(jīng)常存在中間凸的現(xiàn)象 1）加水時不能對著膠沖，要沿著玻璃板緩慢流行 2）加水滿后一定要保證上方水平面是平齊的 3）加膠要避免氣泡，也要避免加膠太慢而提前凝固等現(xiàn)象 4）有其他人的經(jīng)驗是用異丙醇封膠封膠后左右晃一下 三、加樣 1、點樣 樣品盡量不要與電泳液混合，這樣能提高濃縮的效果，因為電泳液PH值為8.3，而樣品為7.5，混合后會影響到樣品的PH值，進而影響濃縮效果。因此，建議點樣最好用長槍頭，或者加樣器，輕輕的將樣品加到孔的底部。 2、如果上樣量超載，要用什么方法來增加上樣量 可以濃縮樣品，也可以根據(jù)目標分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載30％是不會有問題的。如果已經(jīng)超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可以試試1.5mm的。 四、電泳 1、電泳緩沖液 盡量用新鮮配制的。這樣能保證PH值和離子強度的穩(wěn)定 2、電壓條件 我們經(jīng)常用的濃縮時80V，分離時100V比較好，條帶很平 3、轉(zhuǎn)膜 膜的選擇主要從實驗目的和實驗要求來考慮。例如，要做分子量小于20kD的小蛋白，0.45μm的NC膜是不可取的，因為這樣可能會使得蛋白因透過膜孔而造成膜結合的目的蛋白量不確定，從而影響到最終結果的可靠性。而如果所分離的蛋白需要進行測序，則非PVDF膜不可，因為只有PVDF膜才能經(jīng)受住嚴酷的清洗條件。 五、封閉 1、封閉液的選用要求 1）常用封閉液為脫脂牛奶（光明或伊利等）、牛血清白蛋白（BSA）、無蛋白封閉液等 2) 封閉液濃度：封閉時一般用5%脫脂牛奶，也可用1-5%BSA或1%無蛋白封閉液；配制二抗稀釋液一般為1-5%脫脂牛奶，全部用PBS稀釋 3) 封閉時間：室溫1-2h、4度過夜或37度半小時 4) 封閉液pH：一般5%脫脂牛奶pH大約為6.0-6.5左右，而1%脫脂牛奶可能6.5-7，好像RD公司的WB-Protocol中要求封閉液和稀釋抗體的封閉液需要調(diào)pH至7.4；但是大多數(shù)抗體不調(diào)pH也可以做出來 5) 個人經(jīng)驗：5%脫脂牛奶封閉效果最佳，但有時也可能封閉過度，可以與BSA或無蛋白封閉液輪流更換 六、顯色 1、抗體雜交與底物顯色 一抗盡量選擇小鼠或者兔來源的單克隆抗體，還有要注意所用的抗體是否能夠識別變性條件下的目標蛋白；二抗一般都是效價很高的，只要室溫下雜交1小時就可以了，適當延長也是可以的。另外，要選擇靈敏度較高的化學反應底物。 2、WB中抗體的可以重復應用嗎 答：抗體工作溶液一般不主張儲存反復使用，但是如抗體比較珍貴，可反復使用2－3次。稀釋后應在2－3天內(nèi)使用，4度保存，避免反復凍融。 3、免疫組化和WB可以用同一種抗體嗎 答：免疫組化時抗體識別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇（又稱表位），有些表位是線性的，而有的屬于構象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構象型表位由于受蛋白空間結構限制，煮后變性會消失。如果所用的抗體識別的是蛋白上連續(xù)的幾個氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時用于免疫組化和WB，而如果抗體識別構象形表位，則只能用于免疫組化。 第二部分 WB結果不理想可能的原因自查 從結果倒推操作過程中可能的問題，總的來說，WB結果不理想，可能的問題主要集中在以下幾方面部分： 1、陰性結果的原因 1) 二抗條件過低：提高二抗?jié)舛�、延長二抗孵育時間或孵育溫度 2) 一抗條件過低：提高一抗?jié)舛取⒀娱L一抗孵育時間或孵育溫度 3) 抗原過少：提高上樣量 4) 抗體種屬不兼容：一抗species reactivity中是否有需要檢測樣品的種屬來源，一抗與二抗是否相匹配 5) 酶活性：二抗上標記的HRP或AP等酶活性降低，如抗體過期或反復化凍等 6) 封閉過度或封閉劑不兼容：降低封閉劑濃度、縮短封閉時間，或者更換封閉劑種類 7) 底物出現(xiàn)質(zhì)量問題：可以通過點雜交試驗排除底物和酶活性問題 8) 抗體稀釋液pH：注意檢測pH是否在6-8 9）樣品不表達該目的蛋白 10）轉(zhuǎn)膜不足或過頭：優(yōu)化轉(zhuǎn)膜條件 11）其它：PVDF膜、保鮮膜質(zhì)量問題等 12）抗體質(zhì)量：換興譽好的品牌抗體公司，如CST、Millipore、Abcam等 2、有雜帶或背景的原因 1）目的蛋白有多個修飾位點，本身可以呈現(xiàn)多條帶，建議查閱文獻或進行生物信息學分析，獲得蛋白序列的修飾位點信息，通過去修飾確定蛋白實際大小 2) 樣本處理過程中目的蛋白發(fā)生降解,建議加入蛋白酶抑制劑；樣本處理時在冰上操作 3）二聚體或多聚體存在，建議增加蛋白質(zhì)變性過程及強度 4）上樣量過高：降低上樣量，減少抗原含量 5）二抗條件過強：降低二抗?jié)舛取⒖s短二抗孵育時間或改變溫度等 6）一抗條件過強：降低一抗?jié)舛�、縮短一抗孵育時間和改變溫度等 7）抗體質(zhì)量不佳：如特異性不好，建議購買品牌公司的抗體 8）一抗稀釋度不適宜，可以對抗體進行滴度測試，選擇最適宜的抗體稀釋度 9）一抗孵育的溫度偏高，建議4℃結合過夜 10）抗體濃度過高或洗滌不夠，建議降低抗體濃度，增加洗滌次數(shù)和時間 11）膜清洗不全：增加清洗強度，如增加蕩洗次數(shù)、延長清洗時間或加0.05-0.1%Tween 20等 11）ECL發(fā)光液本身因外源污染等原因存在很強的背景光，顯影可以顯示強的背景光，建議分裝A和B液和更換發(fā)光液 12）縮短壓片或曝光時間 13）膜沒有完全均勻濕透，建議使用100% methanol浸透膜 14）電極不平衡或者加樣位置偏斜，可以調(diào)整電極和加樣 15）封閉不全：二抗與抗原有交叉反應，升高封閉劑濃度、延長封閉時間或更換不同的封閉劑，孵育時保證封閉液完全浸沒轉(zhuǎn)印膜 16）封閉物使用不當，比如檢測生物素標記的蛋白時不可用脫脂奶粉封閉； 17）封閉時間不夠，一般情況下室溫37度封閉1小時以上或者4度封閉過夜 18）抗體非特異性結合，可以降低抗體濃度，減少孵育時間 19）化學顯色底物過多，建議按說明書加入適量的顯色底物 3、為啥條帶形狀不好看 1）膠凝的不均勻或聚合不好，建議灌膠前將溶液充分混勻 2）某些樣品鹽濃度較高，建議除鹽或?qū)悠符}濃度調(diào)成一致 3) 緩沖液陳舊，成分改變,可以重配 4) 凝膠下面有氣泡,電泳前要先將氣泡趕走 5）電泳時溫度過高，可以降低電流或電壓 6）樣品中含有不溶性顆粒，建議樣品充分攪拌混勻 4、蛋白條帶位置（大�。┎粚� 1）膠濃度不對，不同濃度的膠跑出的蛋白條帶的位置可能有所偏差，可以調(diào)整濃度 2）抗體孵育不充分,建議增加抗體濃度，延長孵育時間 3）酶失活，建議直接將酶和底物進行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內(nèi)、有活性的酶聯(lián)物 4）目的蛋白存在翻譯后修飾或剪切體，建議查詢相關文獻確定 5）標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低，建議設置陽性對照比對結果，增加標本上樣量 5、背景有黑色斑點或不均勻的白色斑點和暗背景上白色帶 1）抗體與封閉試劑反應，建議使用前過濾封閉試劑 2）HRP含量過高，建議降低酶聯(lián)二抗的濃度 3）HRP偶聯(lián)二抗中有聚集體，建議過濾二抗試劑，去除聚集體 4）抗體分布不均勻，建議孵育抗體時使用搖床 6、為什么我的細胞提取液中沒有檢測到目的蛋白 1）細胞中不表達這種蛋白質(zhì)，換一種細胞 2）抗體不能識別目標蛋白，多看看說明，是否有問題 3）可能是沒有保持低溫操作，樣品保存不當，樣品放置時間過長 4）細胞中的蛋白質(zhì)被酶降解掉了，可加入蛋白酶抑制劑，抑制蛋白酶活性 7、我的目的帶很弱，如何加強 1）可以加大抗原上樣量，這是最主要的 2）也可以將一抗稀釋比例降低 3）還可以延長曝光時間 以上內(nèi)容主要根據(jù)網(wǎng)絡信息收集，方便大家。當然如果有拿不準的，大家可以再繼續(xù)找找相關的信息，祝大家實驗順利。 |
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