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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » PCR相關 » 關于無縫克隆的問題
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關于無縫克隆的問題 已有9人參與
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嗯本人研一實驗室小白一枚，因為是新建立的實驗室，也木的師兄師姐帶，所以來這里求助一下，順便分享下我的經驗 老師讓我把一個13000的基因搞到手 我搞了八個月了，先是分成七段，拿提的cdna當模板p，這些都是小事，后來的拼接最開始用的圣羽的，挺得勁把2+3連起來了，再后來就死活做不出來，做了各種對照，覺得是試劑盒的問題，就換了諾唯贊的，后來就把2+3 4+5 6+7都連起來了，然后連2+3+4+5用的感受態(tài)還是自己實驗室做的dh5，挑菌用第三段尾端設計了個引物，第四段開始設計了個引物，跑出來500bp的帶，也挑出來了。接下來就是1+2+3連起來，然后用當時2+3+4+5連接時的同源臂，順利的把1+2+3+4+5連起來了，測序也對了。 現(xiàn)在的問題是我用諾唯贊的試劑盒死活做不出來了，簡單的4+5+6+7都連不起來，同樣的手法，操作，感受態(tài)換成了買的也是不行，一個多月了，本來已經想好方法只要把4567連上，我就有能力把1234567連上，但是現(xiàn)在做不出來，誰最近做過無縫克隆，有推薦的做出來的試劑盒沒？neb的就算了，也買了做不出來。我可以分享我目前的經驗。 目前就是9200片段+5000pcdna3.1測序正確 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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soarshining
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
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不知道你卡在哪一步？過了這么久解決沒？先寫一些自己的經驗，也希望樓主能分享分享實驗經驗，我也對諾唯贊的無縫克隆頭疼。 我用無縫克隆做缺失突變和插入突變，發(fā)現(xiàn)這個實驗對引物要求相當高，因為需要兩頭互補，引物5`端會有幾個堿基是和模板配不上的，一般我是兩頭各8個。這樣還得保證引物除去這8個后的部分tm值要達到60℃以上，就不得不很長，遇到a/t比較多的有時候引物得有45個bp，這樣的引物特別容易錯配，有時候pcr都能卡你個把月才p出特異性好的條帶。我還遇到過pcr 條帶特異但是大小不對，最后發(fā)現(xiàn)除了需要的片段還多了很多，說明有一頭的引物“特異”的發(fā)生錯配。所以你每次連接理論都需要單克隆測序驗證過然后繼續(xù)往下連。雖然有所謂一次性好幾個片段的，但是運氣不好就會出問題，就是因為引物特異性沒法保證。 另外我發(fā)現(xiàn)不同序列，對于這個15-21的要求也是不一樣的，遇到過死活連不上然后把互補從16個變成20個然后連上的，也遇到過把互補區(qū)域挪移，變成上游留4個下游留12個然后就連起來的。真的挺玄學的。其實就是這個連接過程更深的東西沒有研究透吧。 總的來說其實關鍵就是引物設計，不同長度互補區(qū)，斷口在互補區(qū)域的位置，引物的特異性等等都有影響。 還有，說明書雖然說他家的pcrmix可以直接加入dpni消化模板，但還是建議做pcr回收再消化。有時候會得到模板假陽性。 此外，消化完了建議通過膠回收把目的片段純化然后進行環(huán)化。pcr回收可能都不夠，因為本身這個引物因為需要5`端有一段懸掛片段，容易出現(xiàn)非特異擴增，所以你進行重組環(huán)化的時候，用260/280測得濃度不準，跑膠用條帶亮度去比的結果也不準，加進去的兩個片段濃度就不是最適合的，這也影響連接的效率。做了膠回收，然后再重新跑膠通過條帶亮度結合標曲去定量，這樣子的結果才靠譜。有錢的話買那種定量用的熒光染料去曝光做標曲。 其他暫時沒有了，轉化連接產物盡量帶上不加酶環(huán)化的陰性對照避免假陽性。 ps，無縫克隆，也有叫gibson assemble clone或者infusion clone。 |
14樓2020-05-27 23:16:54
金平果
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2樓2019-08-14 23:07:17
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3樓2019-08-15 09:32:17
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