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[求助]
一直擴不出啟動子全長，只能擴一部分 已有3人參與
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擴增四個植物物種的啟動子，用參考序列設(shè)計的引物（可能特異性不是特別好），只能擴增出后半部分，后面根據(jù)前半部分重新設(shè)計引物，擴增出來了一個物種完整的前半部分，拼接之后，重新設(shè)計全長引物，擴增不出全長，不清楚是什么原因？？另外，最近用原來擴出條帶的引物重新擴增，跑膠后空空如也，都擴不出來了，pcr的條件都未改變，那可能是什么原因呢？會不會是因為DNA反復(fù)凍融，被降解，影響了pcr效果么？另外擴啟動子全長，降落pcr和雙溫pcr效果會不會更好？？ @biostar2009 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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三個選擇方案： 1、多設(shè)計幾對引物，多提幾個基因組，然后重新P。如果還是P不出，建議換高效率高保真酶。如果還是搞不出來，參考2。 2、如果能夠p出目標大小產(chǎn)物，但太弱無法回收做酶切連接等，可以把回收產(chǎn)物作為模板（模板不建議多加，如果回收是30ul，那么模板2~5ul，模板加太多會p不出來），重新PCR。如果還是搞不出來，參考3。 3、如果實在難P，即光板一塊。針對難P的全長啟動子，如果太長，可以設(shè)計兩輪PCR，第一輪：即第一次P出一半部分，第二次P出剩下一半部分（這兩部分需要有重復(fù)交叉），然后回收產(chǎn)物混合；第二輪：用第一輪PCR正向引物F和第二輪反向引物R，模板為回收產(chǎn)物（如果太濃建議稀釋10倍，50ul體系加2ul；如果很弱不稀釋。） 不知道你明白沒有，祝你好運。 |
5樓2019-07-12 11:12:15
王希望
鐵桿木蟲 (正式寫手)
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2樓2019-05-27 16:30:01
xiaomu321
銀蟲 (初入文壇)
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- 專業(yè): 微生物生理與生物化學(xué)
3樓2019-05-30 10:53:07
4樓2019-05-30 13:15:29
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