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餓了就哭新蟲 (初入文壇)
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[求助]
一直擴(kuò)不出啟動(dòng)子全長(zhǎng)，只能擴(kuò)一部分 已有3人參與
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擴(kuò)增四個(gè)植物物種的啟動(dòng)子，用參考序列設(shè)計(jì)的引物（可能特異性不是特別好），只能擴(kuò)增出后半部分，后面根據(jù)前半部分重新設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出來了一個(gè)物種完整的前半部分，拼接之后，重新設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物，擴(kuò)增不出全長(zhǎng)，不清楚是什么原因？？另外，最近用原來擴(kuò)出條帶的引物重新擴(kuò)增，跑膠后空空如也，都擴(kuò)不出來了，pcr的條件都未改變，那可能是什么原因呢？會(huì)不會(huì)是因?yàn)镈NA反復(fù)凍融，被降解，影響了pcr效果么？另外擴(kuò)啟動(dòng)子全長(zhǎng)，降落pcr和雙溫pcr效果會(huì)不會(huì)更好？？ @biostar2009 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
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王希望
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2樓2019-05-27 16:30:01
xiaomu321
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3樓2019-05-30 10:53:07
4樓2019-05-30 13:15:29
【答案】應(yīng)助回帖
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三個(gè)選擇方案： 1、多設(shè)計(jì)幾對(duì)引物，多提幾個(gè)基因組，然后重新P。如果還是P不出，建議換高效率高保真酶。如果還是搞不出來，參考2。 2、如果能夠p出目標(biāo)大小產(chǎn)物，但太弱無法回收做酶切連接等，可以把回收產(chǎn)物作為模板（模板不建議多加，如果回收是30ul，那么模板2~5ul，模板加太多會(huì)p不出來），重新PCR。如果還是搞不出來，參考3。 3、如果實(shí)在難P，即光板一塊。針對(duì)難P的全長(zhǎng)啟動(dòng)子，如果太長(zhǎng)，可以設(shè)計(jì)兩輪PCR，第一輪：即第一次P出一半部分，第二次P出剩下一半部分（這兩部分需要有重復(fù)交叉），然后回收產(chǎn)物混合；第二輪：用第一輪PCR正向引物F和第二輪反向引物R，模板為回收產(chǎn)物（如果太濃建議稀釋10倍，50ul體系加2ul；如果很弱不稀釋。） 不知道你明白沒有，祝你好運(yùn)。 |
5樓2019-07-12 11:12:15
風(fēng)逸1991
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6樓2019-12-16 16:43:59
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正在擴(kuò)啟動(dòng)子，也是遇到了這樣的問題，一共四個(gè)啟動(dòng)子，兩個(gè)可能p出了目的條帶，正打算送測(cè)序，另兩個(gè)怎么都p不出。。。 不知道是啟動(dòng)子的引物都比較難找嗎，我的這四個(gè)找的很艱辛，不是很會(huì)選，最后選了一對(duì)，也加了酶切位點(diǎn) 有個(gè)師兄給我說，他都是在要擴(kuò)增的起始和終止直接設(shè)計(jì)引物，或者稍微外擴(kuò)一些，先擴(kuò)出來再說 想請(qǐng)教一下大佬們，關(guān)于啟動(dòng)子擴(kuò)增的引物設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)之談，以及關(guān)于啟動(dòng)子擴(kuò)增遇到的其他問題和解決的辦法  |
7樓2020-07-02 18:01:52
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