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skynet999新蟲(chóng) (初入文壇)
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[交流]
克隆小白有問(wèn)題請(qǐng)教～～～ 平板無(wú)菌落TT
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求助盆友們～ 最近做了一個(gè)月的cloning無(wú)果… 很悲傷 詳情如下： 載體10787bp EcoRI 和BglII雙酶切 酶切位點(diǎn)很近 都是NEB的酶 取5ugDNA 50ul體系 酶切后成功膠回收 濃度大概160ng/ul PCR產(chǎn)物200bp 為了提高片段濃度 合并了幾次pcr產(chǎn)物 然后膠回收 過(guò)夜雙酶切 也用的50ul體系 酶切后用PCR產(chǎn)物純化Kit 得到PCR產(chǎn)物濃度大概200ng/ul 連接用了20ul體系 T4連接酶1ul 載體4ul PCR產(chǎn)物6ul 室溫連接兩小時(shí)后轉(zhuǎn)化 第二天平板特別干凈 無(wú)克隆菌落… 這是第三次做這個(gè)實(shí)驗(yàn)了 之前兩次也是沒(méi)有克隆 不過(guò)加的載體和PCR產(chǎn)物量比較少 所以這次加大量 還是無(wú)果… 表示不知道什么原因 每次跑膠看條帶也都很正常 實(shí)在找不到癥結(jié)所在 TT 求助大家伙兒……… 發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶(hù)端 |
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淵博震天
版主 (職業(yè)作家)
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5樓2019-05-06 09:00:39
sannny
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小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
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用Gibson無(wú)縫克隆吧，包你一次成功。相當(dāng)簡(jiǎn)單啊。 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶(hù)端 |
2樓2019-05-05 17:55:06
木元雨
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3樓2019-05-05 18:02:18
skynet999
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抗性肯定沒(méi)錯(cuò) 連沒(méi)連上倒是沒(méi)有驗(yàn)證…… 感覺(jué)不應(yīng)該是沒(méi)連上呀  發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶(hù)端 |
4樓2019-05-06 03:38:31
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