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蛇床子素及其制劑在Caco-2 細(xì)胞模型中轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的研究
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分享一篇關(guān)于植物提取物進(jìn)行藥物吸收滲透方面的實(shí)驗(yàn),篇幅較長，為方便大家學(xué)習(xí)，我進(jìn)行了刪減。 目的： 研究蛇床子素及其制劑在Caco-2 細(xì)胞模型中的攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。方法：建立Caco-2 細(xì)胞單層模型，研究蛇床子素、蛇床子素β-環(huán)糊精包合物及其包合物分散片的攝取和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，考察其時(shí)間、溫度、濃度、吸收促進(jìn)劑和抑制劑對(duì)藥物攝取及跨膜吸收的影響，并比較原料藥與制劑吸收過程的差異。結(jié)果：Caco-2 細(xì)胞對(duì)蛇床子素及其制劑溶液的攝取與時(shí)間、溫度、濃度均呈正相關(guān)，p-糖蛋白抑制劑（CyA）與能量抑制劑（NaN3）對(duì)攝取無顯著性影響，其攝取量的大小依次為分散片＞包合物＞原料藥；轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)中，隨濃度和溫度的增加，蛇床子素及其制劑的溶液在Caco-2 細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)量均增加，而PAP 與PBL 比值無明顯變化，p-糖蛋白抑制劑（CyA）、能量抑制劑（NaN3）、細(xì)胞內(nèi)吞抑制劑-氧化苯砷(oxophenylarsine)及細(xì)胞旁路轉(zhuǎn)運(yùn)促進(jìn)劑-去氧膽酸鈉(sodium deoxycholate，SDCh)對(duì)蛇床子素的轉(zhuǎn)運(yùn)無影響，而去氧膽酸鈉對(duì)包合物和分散片的轉(zhuǎn)運(yùn)有明顯的影響，3 種制劑AP-BL 方向上的Papp為分散片＞包合物＞原料藥。結(jié)論：蛇床子素主要以被動(dòng)擴(kuò)散的方式被吸收，包合物和分散片中的藥物以被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)為主，少部分以細(xì)胞旁路轉(zhuǎn)運(yùn)途徑被細(xì)胞吸收；難溶性藥物經(jīng)包合物可促進(jìn)其吸收，制劑輔料對(duì)藥物的吸收有一定的促進(jìn)作用。 1. Caco-2 細(xì)胞培養(yǎng) 用DMEM 培養(yǎng)液(高糖)，包括10% 胎牛血清、1% 非必需氨基酸、1% L-谷氨酰胺和1% 青-鏈霉素。將Caco-2 細(xì)胞移入卡氏培養(yǎng)瓶中，并置于37 ℃ 培養(yǎng)箱中，通入5% CO2 培養(yǎng)。 2.蛇床子素儲(chǔ)備液的制備 精密稱取蛇床子素對(duì)照品10.0 mg 于10 mL 量瓶中，用乙醇定容，搖勻，制成1.0 mg/mL 的儲(chǔ)備液。 3. 蛇床子素供試液的制備 精密量取適量蛇床子素儲(chǔ)備夜，用PBS 溶液配制成質(zhì)量濃度分別為10，50，100，200，500 μg/mL供試液（DMSO助溶，含量<0.1%），并制備相應(yīng)藥物濃度下的蛇床子素制劑的供試液，過濾除菌，用于MTT 實(shí)驗(yàn)。 4. MTT 法細(xì)胞毒性的評(píng)價(jià) 細(xì)胞毒性的測(cè)定采用噻唑藍(lán)MTT 比色法(MTTassay)。收集對(duì)數(shù)生長期Caco-2 細(xì)胞，按每孔10000 個(gè)細(xì)胞接種于96 孔板中，邊緣孔用PBS填充，孵育12~24 h，至細(xì)胞單層鋪滿孔底，吸棄培養(yǎng)液，按一定順序分別向每孔中加入“2.5”項(xiàng)下的Ost 儲(chǔ)備液各100 μL，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，不含藥物的孔作為陰性對(duì)照，培養(yǎng)液作調(diào)零孔。將其培養(yǎng)36~48 h 后，每孔加入5 mg/mL MTT 溶液20 μL，繼續(xù)孵育4~6 h，終止培養(yǎng)，小心吸去上層液體，用PBS 溶液沖洗3 次。每孔中加入DMSO 100 μL，置搖床低速振蕩15 min，置酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，在630 nm 波長處測(cè)各孔的吸光值，確定藥物對(duì)Caco-2 細(xì)胞的安全濃度范圍。 5. Caco-2 細(xì)胞攝取的實(shí)驗(yàn) 取Caco-2 細(xì)胞于6 孔板中培養(yǎng)，每孔1.0×104個(gè)細(xì)胞，置37 ℃，5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 d。試驗(yàn)前用空白pH 7.4 PBS等滲溶液，置37 ℃ 培養(yǎng)20 min，吸去緩沖溶液。用空白緩沖溶液輕輕清洗2 次，洗去細(xì)胞單分子層表面的雜質(zhì)。加入“2.5”蛇床子素供試品溶液的制備項(xiàng)下蛇床子素及2 種制劑溶液各2 mL，分別考察藥物濃度（20，60，100 μg/L）、時(shí)間（5，15，30 min）、溫度(4，25，37 ℃)、p-糖蛋白抑制劑CyA(50 μmol/L)、能量抑制劑NaN3(25mmol/L)對(duì)細(xì)胞攝取的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，加入空白PBS 溶液終止細(xì)胞攝取試驗(yàn)，并將細(xì)胞單分子層快速清洗2 次，加入2 mL 空白PBS 液，用細(xì)胞刮取器將細(xì)胞刮入Ep 管中，超聲粉碎細(xì)胞，一部分按“細(xì)胞樣品的處理”項(xiàng)下方法操作后，測(cè)定藥物濃度；一部分用考馬思亮藍(lán)法測(cè)定細(xì)胞蛋白含量[14]，求算細(xì)胞的攝取量ω(μg/mg），求得ω(μg/mg）＝COst/CProtein。 注：式中COst 為細(xì)胞中Ost 的質(zhì)量濃度（μg/mL）；CProtein為細(xì)胞懸液中細(xì)胞蛋白的質(zhì)量濃度（mg/mL)。 6. Caco-2 細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的實(shí)驗(yàn) 用培養(yǎng)21 d，符合攝取條件，其細(xì)胞生長形態(tài)完好的Millicell 膜，試驗(yàn)前用空白pH 7.4 PBS 等滲溶液，置37 ℃ 下培養(yǎng)20 min，清洗2 次，洗去細(xì)胞單分子層表面的雜質(zhì)�？疾霢P 側(cè)BL 側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)，在AP 側(cè)加入藥物溶液0.5 mL 作為供給液，在BL 側(cè)加入1.5mL 空白PBS 液作為接收液。對(duì)于從BL 側(cè)到AP 側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)：將1.5 mL 藥物溶液加到BL 側(cè)作為供給液，0.5 mL 空白pH7.4 PBS 液加到AP 側(cè)作為接收液；待分別在5，15，30，60，120 min 時(shí)吸取100 μL 接收液，測(cè)定藥物濃度，計(jì)算表觀透過系數(shù)（Papp)，求得Papp＝1.0×10－6 cm/s；同時(shí)補(bǔ)加等量37 ℃ 空白PBS液以及考察濃度（20，60，100 μg/mL）、溫度（4，25，37 ℃）、p-糖蛋白抑制劑（CyA，50μmol/L)、能量抑制劑（NaN3）(25 mmol/L)、細(xì)胞內(nèi)吞抑制劑-氧化苯砷(oxophenylarsine)(25 mmol/L)及細(xì)胞旁路轉(zhuǎn)運(yùn)促進(jìn)劑- 去氧膽酸鈉(sodium deoxycholate，SDCh)（100mmol/L）對(duì)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。按下列公式計(jì)算：表觀透過系數(shù)Papp＝(dQ/dt)/(A×C0)。 注：式中dQ/dt 為接受端受試藥物出現(xiàn)的速率(μg/min)；A 指聚碳酯膜表面積(≈1.1cm2)，C0是藥物在供體室的初始濃度）表觀滲透率PDR＝Papp(B → A)/Papp(A → B)注：Papp(B→ A)為基底側(cè)BL到腸腔側(cè)AP的表觀透過系數(shù)；Papp(A→ B)為腸腔側(cè)AP到基底側(cè)BL的表觀透過系數(shù)。 詳細(xì)信息可以查看原文獻(xiàn)哈《蛇床子素及其制劑在Caco-2 細(xì)胞模型中轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的研究》。 |
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nono20092樓
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youngen3樓
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Biotage5樓
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echocys7樓
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dqh09939樓
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xhmaohan11樓
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