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蛇床子素及其制劑在Caco-2 細胞模型中轉(zhuǎn)運機制的研究
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分享一篇關(guān)于植物提取物進行藥物吸收滲透方面的實驗,篇幅較長，為方便大家學(xué)習，我進行了刪減。 目的： 研究蛇床子素及其制劑在Caco-2 細胞模型中的攝取、轉(zhuǎn)運機制。方法：建立Caco-2 細胞單層模型，研究蛇床子素、蛇床子素β-環(huán)糊精包合物及其包合物分散片的攝取和跨膜轉(zhuǎn)運，考察其時間、溫度、濃度、吸收促進劑和抑制劑對藥物攝取及跨膜吸收的影響，并比較原料藥與制劑吸收過程的差異。結(jié)果：Caco-2 細胞對蛇床子素及其制劑溶液的攝取與時間、溫度、濃度均呈正相關(guān)，p-糖蛋白抑制劑（CyA）與能量抑制劑（NaN3）對攝取無顯著性影響，其攝取量的大小依次為分散片＞包合物＞原料藥；轉(zhuǎn)運實驗中，隨濃度和溫度的增加，蛇床子素及其制劑的溶液在Caco-2 細胞中的轉(zhuǎn)運量均增加，而PAP 與PBL 比值無明顯變化，p-糖蛋白抑制劑（CyA）、能量抑制劑（NaN3）、細胞內(nèi)吞抑制劑-氧化苯砷(oxophenylarsine)及細胞旁路轉(zhuǎn)運促進劑-去氧膽酸鈉(sodium deoxycholate，SDCh)對蛇床子素的轉(zhuǎn)運無影響，而去氧膽酸鈉對包合物和分散片的轉(zhuǎn)運有明顯的影響，3 種制劑AP-BL 方向上的Papp為分散片＞包合物＞原料藥。結(jié)論：蛇床子素主要以被動擴散的方式被吸收，包合物和分散片中的藥物以被動轉(zhuǎn)運為主，少部分以細胞旁路轉(zhuǎn)運途徑被細胞吸收；難溶性藥物經(jīng)包合物可促進其吸收，制劑輔料對藥物的吸收有一定的促進作用。 1. Caco-2 細胞培養(yǎng) 用DMEM 培養(yǎng)液(高糖)，包括10% 胎牛血清、1% 非必需氨基酸、1% L-谷氨酰胺和1% 青-鏈霉素。將Caco-2 細胞移入卡氏培養(yǎng)瓶中，并置于37 ℃ 培養(yǎng)箱中，通入5% CO2 培養(yǎng)。 2.蛇床子素儲備液的制備 精密稱取蛇床子素對照品10.0 mg 于10 mL 量瓶中，用乙醇定容，搖勻，制成1.0 mg/mL 的儲備液。 3. 蛇床子素供試液的制備 精密量取適量蛇床子素儲備夜，用PBS 溶液配制成質(zhì)量濃度分別為10，50，100，200，500 μg/mL供試液（DMSO助溶，含量<0.1%），并制備相應(yīng)藥物濃度下的蛇床子素制劑的供試液，過濾除菌，用于MTT 實驗。 4. MTT 法細胞毒性的評價 細胞毒性的測定采用噻唑藍MTT 比色法(MTTassay)。收集對數(shù)生長期Caco-2 細胞，按每孔10000 個細胞接種于96 孔板中，邊緣孔用PBS填充，孵育12~24 h，至細胞單層鋪滿孔底，吸棄培養(yǎng)液，按一定順序分別向每孔中加入“2.5”項下的Ost 儲備液各100 μL，每個濃度設(shè)5個復(fù)孔，不含藥物的孔作為陰性對照，培養(yǎng)液作調(diào)零孔。將其培養(yǎng)36~48 h 后，每孔加入5 mg/mL MTT 溶液20 μL，繼續(xù)孵育4~6 h，終止培養(yǎng)，小心吸去上層液體，用PBS 溶液沖洗3 次。每孔中加入DMSO 100 μL，置搖床低速振蕩15 min，置酶聯(lián)免疫檢測儀，在630 nm 波長處測各孔的吸光值，確定藥物對Caco-2 細胞的安全濃度范圍。 5. Caco-2 細胞攝取的實驗 取Caco-2 細胞于6 孔板中培養(yǎng)，每孔1.0×104個細胞，置37 ℃，5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 d。試驗前用空白pH 7.4 PBS等滲溶液，置37 ℃ 培養(yǎng)20 min，吸去緩沖溶液。用空白緩沖溶液輕輕清洗2 次，洗去細胞單分子層表面的雜質(zhì)。加入“2.5”蛇床子素供試品溶液的制備項下蛇床子素及2 種制劑溶液各2 mL，分別考察藥物濃度（20，60，100 μg/L）、時間（5，15，30 min）、溫度(4，25，37 ℃)、p-糖蛋白抑制劑CyA(50 μmol/L)、能量抑制劑NaN3(25mmol/L)對細胞攝取的影響。實驗結(jié)束后，加入空白PBS 溶液終止細胞攝取試驗，并將細胞單分子層快速清洗2 次，加入2 mL 空白PBS 液，用細胞刮取器將細胞刮入Ep 管中，超聲粉碎細胞，一部分按“細胞樣品的處理”項下方法操作后，測定藥物濃度；一部分用考馬思亮藍法測定細胞蛋白含量[14]，求算細胞的攝取量ω(μg/mg），求得ω(μg/mg）＝COst/CProtein。 注：式中COst 為細胞中Ost 的質(zhì)量濃度（μg/mL）；CProtein為細胞懸液中細胞蛋白的質(zhì)量濃度（mg/mL)。 6. Caco-2 細胞轉(zhuǎn)運的實驗 用培養(yǎng)21 d，符合攝取條件，其細胞生長形態(tài)完好的Millicell 膜，試驗前用空白pH 7.4 PBS 等滲溶液，置37 ℃ 下培養(yǎng)20 min，清洗2 次，洗去細胞單分子層表面的雜質(zhì)�？疾霢P 側(cè)BL 側(cè)的轉(zhuǎn)運，在AP 側(cè)加入藥物溶液0.5 mL 作為供給液，在BL 側(cè)加入1.5mL 空白PBS 液作為接收液。對于從BL 側(cè)到AP 側(cè)轉(zhuǎn)運：將1.5 mL 藥物溶液加到BL 側(cè)作為供給液，0.5 mL 空白pH7.4 PBS 液加到AP 側(cè)作為接收液；待分別在5，15，30，60，120 min 時吸取100 μL 接收液，測定藥物濃度，計算表觀透過系數(shù)（Papp)，求得Papp＝1.0×10－6 cm/s；同時補加等量37 ℃ 空白PBS液以及考察濃度（20，60，100 μg/mL）、溫度（4，25，37 ℃）、p-糖蛋白抑制劑（CyA，50μmol/L)、能量抑制劑（NaN3）(25 mmol/L)、細胞內(nèi)吞抑制劑-氧化苯砷(oxophenylarsine)(25 mmol/L)及細胞旁路轉(zhuǎn)運促進劑- 去氧膽酸鈉(sodium deoxycholate，SDCh)（100mmol/L）對藥物轉(zhuǎn)運的影響。按下列公式計算：表觀透過系數(shù)Papp＝(dQ/dt)/(A×C0)。 注：式中dQ/dt 為接受端受試藥物出現(xiàn)的速率(μg/min)；A 指聚碳酯膜表面積(≈1.1cm2)，C0是藥物在供體室的初始濃度）表觀滲透率PDR＝Papp(B → A)/Papp(A → B)注：Papp(B→ A)為基底側(cè)BL到腸腔側(cè)AP的表觀透過系數(shù)；Papp(A→ B)為腸腔側(cè)AP到基底側(cè)BL的表觀透過系數(shù)。 詳細信息可以查看原文獻哈《蛇床子素及其制劑在Caco-2 細胞模型中轉(zhuǎn)運機制的研究》。 |
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17樓2019-05-06 09:45:22
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nono20092樓
2019-05-02 10:24
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youngen3樓
2019-05-02 15:39
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Biotage5樓
2019-05-02 22:07
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echocys7樓
2019-05-02 22:32
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dqh09939樓
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tzynew10樓
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xhmaohan11樓
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dongmings13樓
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liubq0814樓
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shenrenren15樓
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miaojiabing16樓
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youngen18樓
2019-05-06 13:27
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