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[求助]
求助：大腸桿菌red同源重組一直出現(xiàn)假陽性 已有3人參與
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最近一直在做red同源重組，將外源基因整合至K-12大腸桿菌染色體組上，電轉后能長出菌落，但驗證全都是假陽性線性 1.我用的是鏈霉素篩選，不知道是不是因為抗生素原因導致這么多假陽性？ 2.我的整合片段較大有4000bp做有，同源臂選的是50bp，會不會太短，我是否需要延長同源臂長度？但查閱文獻感覺K系列菌株50bp貌似足夠了 3.是不是我挑的菌落太少？板上長了很多，但我來來回回也挑了有四五十個了，但一直都是假陽性，而且我在新的鏈霉素抗性板上劃線，雖然假陽性但也能長起來。。 我的試驗步驟： 以質粒為模板擴增打靶片段，DpnI消化后濃縮到260ng/uL打靶片段。 電轉感受態(tài)細胞制備，預冷純水洗一次，10%甘油洗兩次，最后分裝100ul每管，電轉加入5ul片段 電擊后加入1ml SOC培養(yǎng)基，170rpm 3h，離心濃縮到100ul涂板，37℃培養(yǎng)16h 菌落PCR是在整合片段上下游200bp開外 求各位大神指導！在這個基因上耗了太長時間了，要崩潰了。。。。  |
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