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[求助]
求助：大腸桿菌red同源重組一直出現(xiàn)假陽性 已有3人參與
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最近一直在做red同源重組，將外源基因整合至K-12大腸桿菌染色體組上，電轉(zhuǎn)后能長出菌落，但驗(yàn)證全都是假陽性線性 1.我用的是鏈霉素篩選，不知道是不是因?yàn)榭股卦驅(qū)е逻@么多假陽性？ 2.我的整合片段較大有4000bp做有，同源臂選的是50bp，會(huì)不會(huì)太短，我是否需要延長同源臂長度？但查閱文獻(xiàn)感覺K系列菌株50bp貌似足夠了 3.是不是我挑的菌落太少？板上長了很多，但我來來回回也挑了有四五十個(gè)了，但一直都是假陽性，而且我在新的鏈霉素抗性板上劃線，雖然假陽性但也能長起來。。 我的試驗(yàn)步驟： 以質(zhì)粒為模板擴(kuò)增打靶片段，DpnI消化后濃縮到260ng/uL打靶片段。 電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞制備，預(yù)冷純水洗一次，10%甘油洗兩次，最后分裝100ul每管，電轉(zhuǎn)加入5ul片段 電擊后加入1ml SOC培養(yǎng)基，170rpm 3h，離心濃縮到100ul涂板，37℃培養(yǎng)16h 菌落PCR是在整合片段上下游200bp開外 求各位大神指導(dǎo)！在這個(gè)基因上耗了太長時(shí)間了，要崩潰了。。。。  |
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成事想心
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4樓2019-09-19 11:46:29
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- 專業(yè): 生物物理、生物化學(xué)與分子
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根據(jù)你的描述，建議做一個(gè)K-12的耐藥性試驗(yàn)，將鏈霉素稀釋成不同的工作濃度，可能工作濃度調(diào)高一點(diǎn)假陽性就少了。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
3樓2019-05-04 12:45:12
 本帖僅樓主可見 |
5樓2019-09-19 21:23:07
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